《基因克隆操作过程》PPT课件

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1、第六章基因克隆操作过程2011-10-231基因克隆操作过程基因克隆操作过程基因克隆操作过程概述1.DNA的体外重组——酶切和连接（切、接）2.重组DNA分子的转化和扩增（转、增）3.转化子的筛选和鉴定（检）2011-10-232切接检转增restrictionendonucleaseDNAligase2011-10-233基因克隆操作过程一、DNA的体外重组（切与接）2011-10-234基因克隆操作过程1.DNA的体外重组（一）——切工具：限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）作用对象：目的基因片段、载体目的：获得具有互补粘性

2、末端（或平末端）的线性目的基因片段和线性化载体2011-10-235基因克隆操作过程6基因克隆操作过程HindIIIEcoRIPvuII2011-10-237基因克隆操作过程双酶联合酶切所使用的buffer（Takara）各种限制酶酶切反应所使用的buffer（Takara）2011-10-23单酶切实例（Takara）2011-10-238基因克隆操作过程双酶联合酶切实例（Takara）2011-10-239基因克隆操作过程2.DNA的体外重组（二）——接工具：DNA连接酶（DNAligase）作用对象：具有互补粘性末端（或平末端）的线性目的基因片段和线性

3、化载体目的：获得含有目的基因的环状载体2011-10-2310基因克隆操作过程2011-10-235'5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'GCTTAAAATTCG5'5'GCTTAA5'5'AATTCG5'GCTTAAAATTCG5'GCTTAA5'AATTCGGCTTAAAATTCG5'GCTTAA5'AATTCGGAATTCCTTAAG5'5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'5'GAATTCCTTAAGEcoRI退火T4-DNAligasea)获得连接方向不同的两种产物；b)需要鉴定目的基因的连接方向（1）单酶切产

4、生的粘性末端的连接11基因克隆操作过程同尾酶：能切割产生相同末端的限制性内切酶。同尾酶一般是指能产生相同粘性末端的限制酶。所有钝末端酶产生的末端均是相同的，但一般不作为同尾酶来研究。同尾酶是不同的酶，它们只是切割DNA产生的末端相同，同尾酶之间的识别序列可以相同也可以不同基因工程中识别序列不同的同尾酶的应用性最大（2）同尾酶产生的粘性末端的连接Takara网站提供的同尾酶信息2011-10-2312基因克隆操作过程5'5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'5'TACTAG5'5'GATCAT5'GCCTAGGAT

5、CCG5'TACTAG5'GATCATTGATCCACTAGG5'5'GGATCACCTAGT5'TGATCAACTAGT5'GCCTAGGATCCG5'TACTAG5'GATCATTGATCCACTAGG5'5'GGATCACCTAGTBclIBamHI退火T4-DNAligasea)获得连接方向不同的两种产物；b)需要鉴定目的基因的连接方向；c)目的产物中对应位置的序列不再是原来的酶切位点2011-10-2313基因克隆操作过程5'5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'5'CTGCAG5'GACGTC3'CG

6、ATCCGCTAGG5'5'GGATCGCCTAGC5'CTGCAGGACGTC5'3'切平5'CG5'GC补平5'GGATCCCTAGGATCC5'CTAGGCGATCCGCTAGG5'5'GGATCGCCTAGC（3）不同粘性末端的连接PstIBamHIT4-DNApolymeraseKlenowT4-DNAligasea)获得连接方向不同的两种产物；b)需要鉴定目的基因的连接方向；c)目的产物中对应位置的序列不再是原来的酶切位点2011-10-2314基因克隆操作过程（4）双酶联合酶切产生的不同粘性末端的连接CTGCAGNNNNNNNNNGGATCCG

7、ACGTCNNNNNNNNNCCTAGGPstICTGCAGATCCGGBamHIGGATCCCTGCAGCCTAGGGACGTCPstIBamHIGATCCCTGCAGG退火CTGCAGGGATCCGACGTCCCTAGGT4-DNAligaseCTGCAGGGATCCGACGTCCCTAGGa)连接产物中目的基因的方向是确定的。2011-10-2315基因克隆操作过程基因克隆操作过程5'GCCTAGGATCCG5'5'GCTTAA5'5'5'AATTCG5'5'5'GGATCCCTAGGATCC5'CTAGG5'GAATTCTTAA5'5'5'AATTC

8、TTAAGGAATTGGGGGGCTTAAAATTC