《分子克隆实验设计》PPT课件

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1、分子克隆实验原理分子克隆实验原理一、菌种保存和活化二、质粒提取和保存三、感受态细胞的制备四、载体的制备五、基因的制备六、连接七、转化八、重组克隆的筛选菌种保存和活化一.甘油菌保存：1、100ul菌液＋100ul灭菌甘油【混匀】2、多制备几管，做上标记【菌名，质粒，时间】3、－20℃可保存半年；【－80℃可长期保存】二、甘油菌活化：1、取一管甘油菌，混匀；2、用接种针接种并在培养平板上划线；3、37℃倒置培养12h；4、挑单克隆于2.5mlLB(视情况加抗生素），37℃振荡培养12h.【注明：甘油菌用完后，最好扔掉，反复冻融易死亡。】质粒的提取原理－碱裂解法三种溶液：溶液1

2、：50mmol/l葡萄糖----------------维持渗透压，防止DNA受机械损伤降解；25mmol/lTri·Cl（pH8.0)---维持pH;10mmol/lEDTA(pH8.0)------螯合Ca2+,DNase失活，保护DNA溶液2：0.2mol/NaOH--------------------核酸变性（pH>12或pH<3)(解链）1%SDS-----------------------------蛋白变性，裂解细胞。溶液3：7.5mol/LNH4AC（pH7.6)-------沉淀蛋白，大分子核酸，调节pH,使小分子核酸复性（可溶）。其它溶液：（1）2

3、MNH4AC------------------------------沉淀蛋白，溶解核酸；(2)异丙醇-----------------------------沉淀质粒（3）70％乙醇---------------------------沉淀质粒，除去异丙醇，盐分。(4)RNase--------------------------------除去细菌RNA质粒的提取原理－碱裂解法Protocal:1.5ml菌液，12000rpm*1min,弃上清（repeat)－－收集细菌溶液1(200ul),剧烈混匀－－－－－－－－－－－－－提供缓冲液溶液2(400ul)，温柔混匀

4、，冰中5min;－－－－－－－裂解细胞，蛋白核酸变性溶液3(300ul),温柔混匀，冰中10min;－－－－－－－质粒复性13000rpm*5min,取上清；－－－－－－－－－－－－除去细菌蛋白，基因DNA540ul异丙醇，室温10min;－－－－－－－－－－－－沉淀质粒14000rpm*10min,弃上清；－－－－－－－－－－－－除去可溶性杂质100ul2MNH4AC13000rpm*5min,取上清；100ul异丙醇，室温10min;14000rpm*10min,弃上清；70%乙醇500ul,14000rpm*10min,弃上清；－－－－－除去异丙醇，盐分烘干10-3

5、0min,－－－－－－－－－－－－－－－－－除去乙醇50ulddH2O(含0.1mg/mlRNase),37°C*30min.－－－－除去细菌RNA电泳鉴定初抽精抽除去少量杂质蛋白质粒的保存1.ddH2O(可含EDTA)中可短期保存[4℃保存1月;-20℃可保存一年]2.75%乙醇可长期保存.3.烘干可长期保存(可能难溶)感受态细胞的制备1.菌种活化2.取0.5ml菌液至50mlLB培养液中；3、37℃，振荡培养2h至对数期；4、转至50ml无菌塑料管，0℃*10min;5、5000rpm*10min*4℃6、取沉淀，加25ml50mMCaCl2【0℃，无菌】7、5000

6、rpm*10min*4℃8、取沉淀,加2ml含15％甘油的50mMCaCl2重悬，200ul/tube分装，液氮速冻后至－80℃冰箱保存（半年有效）。【注意：（1）需要做一个无质粒的对照（2）并用已知质粒转化，鉴定感受态细胞的转化效率－－大约106【1ugPUC质粒，产生克隆106】载体的制备1、酶切（放大体积100ul，要充分)2、胶回收（注意远紫外照射时间不能太长，防止DNA突变）3、纯度，浓度测定。(电泳测定）基因的制备(*)1、PCR扩增2.酶切3、胶回收4、纯度，浓度测定连接1、总体积为10ul；2、16℃连接过夜；3、基因mol/载体mol≈10;【平端≈15

7、】转化1、连接产物5ul加入感受态细胞中；2、混匀，冰上30min-------cell吸附DNA3、42℃,90s－－－－热击，促进DNA进入cell4、冰上1～2min－－使细胞复原5、加1mlLB(无Amp)－－外源DNA还未表达6、37℃培养1h－－Amp抗性基因表达7、6000rpm*30s，浓缩100ul8、涂板（Amp板）－－抗性筛选9、37℃培养过夜。重组克隆的筛选*1、抗性筛选；2、蓝白斑筛选；3、酶切电泳筛选(*)；4、PCR筛选；5、测序验证；6、表达筛选；7、生物活性筛选。抗性筛选--质粒载体携带的筛选