《分子克隆总》PPT课件

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1、浪淘沙千淘万漉虽辛苦，吹尽黄沙始到金!刘禹锡生物工程专业核心课程基因工程张文峰zwfsnowdream@126.com基因工程基本流程第二章分子克隆单元操作2.22.32.1用于基因克隆的载体DNA的体外重组（切与接）目的基因的克隆2.4基因操作常用技术转化与扩增（转与增）转化子的筛选与重组子的鉴定（检）2.52.6基因工程课程内容523416789基因工程概论分子克隆单元操作大肠杆菌基因工程非肠道细菌基因工程真菌基因工程昆虫基因工程高等动物基因工程高等植物基因工程蛋白质工程、途径工程2.1用于基因克隆的载体质粒载体噬菌体或病

2、毒载体考斯质粒与噬菌粒人工染色体载体载体的基本概念一、载体的基本概念载体（Vector）：是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增或表达的工具。载体的主要功能：运载：高效运载外源基因至受体细胞内维持：自主复制或整合至宿主基因组，以达传代目的扩增：使外源基因拷贝数增加（克隆载体）表达：为目的基因表达提供顺式元件（表达载体）2、载体应具备的条件可转移性：具有针对受体细胞的“亲缘性”或“亲和性”可筛选性：具有合适的筛选标记具有一定的装载能力：在插入外源基因后仍能有效转化宿主基因文库构建需要非常大的容量方便外源基因克隆：

3、具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点(多克隆位点)可传代性：具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点由复制或整合位点和标记基因决定3、载体类型克隆载体（cloningvector）主要用于在大肠杆菌细胞中克隆目的基因，或在大肠杆菌或酿酒酵母细胞中构建基因文库。表达载体（expressionvector)除含基因克隆所需元件外，还有供外源基因表达用的启动子、终止子等顺式元件，用于在特定的宿主中表达目的基因。1）按功能分：3、载体类型自主复制型载体含复制子，可独立于宿主染色体外复制与传代。穿梭载体装有针对两种不同受体的复制子，

4、便于基因克隆整合型载体不含复制子，需借助同源重组机制整合于宿主基因组。2）按传代特性分：3、载体类型质粒（Plasmid)噬菌体（bacteriophage)/病毒(virus)考斯质粒（cosmid）噬菌粒（phagemid）人工染色体（YAC，BAC）3）按来源分：二、质粒(plasmid)质粒的生物学特性质粒载体的特点与类型几个重要的质粒载体质粒的制备与鉴定（一）质粒的生物学特性质粒：是生物细胞内固有的、能独立于宿主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类DNA分子。*质粒常见于原核细菌和真菌中*绝大多数的天然DNA质粒具有

5、共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA（covalentlyclosedcircularDNA)*质粒DNA的分子量范围：1-300kb1、质粒的自主复制性质粒是独立的复制子（replicon）：含复制起始位点（origin,ori)和控制复制频率的调控基因能利用宿主细胞的DNA复制系统进行自主复制(ori)质粒的复制调控：调控区紧邻ori，方便构建调控区编码RNAI（反义）和Rop蛋白，抑制复制引物RNAII与模板结合oriE.coliColE1plasmid复制方向rop（+）RopRNAII（引物）RNAI3’5’5

6、’3’63个氨基酸,提高RNAI的抑制调控区编码抑制蛋白Cop，控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合PcopcopP/OrepreporiCopRep起始因子抑制蛋白质如何通过质粒改造提高质粒的拷贝数？根据质粒复制调控的严密程度，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒：1-3拷贝，如pSC101松弛型复制控制的质粒：10-60拷贝，如ColE1氯霉素扩增：在宿主菌生长的中后期，通过添加氯霉素抑制蛋白质合成、关闭主要代谢途径，以使松弛型质粒迅速大量扩增（可达上千拷贝）的操作。2、质粒的不相容性质粒的不相容性：任何

7、两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中的现象。不相容性的质粒组成不相容性群以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容质粒的不相容性的分子机制两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，可导致子代细胞质粒组成不同，且这种差异具随机性，经过若干代后宿主细胞中处于数量弱势的质粒必然被淘汰，而仅剩强势质粒。3、质粒的可

8、转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等如Col、R的其它成员非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发