《分子克隆》PPT课件

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1、分子克隆南京农业大学动物医学院基础兽医系动物生化教研室医学分子生物学基础1第五章分子克隆重组DNA技术（recombinantDNAtechnology）是按照人的意愿、在体外对DNA分进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。克隆(clone)是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。2载体和目的基因的分离；载体和目的基因的切断；载体和目的基因的重组；重组DNA的转化和扩增；重组DNA的筛选和鉴定。第一节基因工程技术路线3基因重组技术的两个基本目的：1.

2、直接利用基因主导生长的基因、作物的抗性基因、基因诊断、基因治疗、指纹图谱等。2.利用基因的表达产物疫苗、药物、组织激活物、生长因子、珍稀蛋白等。第一节基因工程技术路线4工具酶：指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统。限制性核酸内切酶DNA聚合酶逆转录酶DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶TaqDNA聚合酶第二节分子克隆常用的工具酶5工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子

3、或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基第二节分子克隆常用的工具酶6一、限制性内切酶○酶有

4、几千种，分为6大类：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、连接酶。○基因工程中常用作用于核酸的酶，包括水解酶、修饰酶、聚合酶等水解酶分为内切酶和外切酶○内切酶在核酸链内部切割，生成寡核苷酸；外切酶从核酸链的末端开始，渐进式地水解核酸链，逐渐释放单核苷酸。第二节分子克隆常用的工具酶7有特定的识别序列但切割位置远离识别位置有的种类可以在同识别序列相距1000bp的位置上随机切割DNA分子在基因工程中没有什么用途Ⅰ型限制酶第二节分子克隆常用的工具酶8Ⅲ型限制酶有特定的识别序列切割位置在识别序列3’端相距20bp处，

5、可以产生各种类型的单链末端。Ⅲ型限制酶在基因工程中有特定的用途，但总体来说，用途不大。第二节分子克隆常用的工具酶9Ⅱ型限制酶在DNA上有特定的识别序列而且其切割位点就在识别序列内部基因工程中用途最广识别序列是对称的，在一条链中从5’到3’方向的序列与其互补链从5’到3’方向的序列完全相同，称为回纹对称序列(palindrome)。第二节分子克隆常用的工具酶10限制性内切酶的命名属名＋种名＋菌株类型＋发现的顺序第二节分子克隆常用的工具酶11限制性核酸内切酶具有内切和甲基化两种功能能够识别外源的核酸并将它切除有特异的识

6、别位点，通常为4-6对碱基的旋转对称结构在其切口处留下黏性末端（stickyend）—具有互补序列的单股链，或者平头末端（bluntend）有3种类型，II型为主。第二节分子克隆常用的工具酶12第二节分子克隆常用的工具酶13EcoRI酶切不同来源的DNA及退火重组第二节分子克隆常用的工具酶14第二节分子克隆常用的工具酶15第二节分子克隆常用的工具酶16同尾酶：即识别序列不同，但酶切后产生同样的黏性末端的两种酶。同裂酶：来源不同，但能识别和切割同一位点，但在切点位置上对甲基化碱基的敏感性不同。第二节分子克隆常用的工具

7、酶17第二节分子克隆常用的工具酶18限制性内切酶的主要用途○重组DNA分子匹配末端的连接：同一种酶切割不同DNA分子产生相同的突出末端；或不同酶切割不同DNA分子产生相同的突出末端，可在连接酶作用下连接为重组DNA分子。平端连接：可直接连接，但效率较低。不匹配黏端的连接：先补平(Klenow)或修平(S1)后再连接。绘制物理图谱（限制性内切酶图谱）第二节分子克隆常用的工具酶19影响限制性核酸内切酶活性的因素：DNA的纯度。DNA的甲基化程度。酶切消化反应的温度。DNA的分子结构。限制性核酸内切酶的缓冲液。第二节分子

8、克隆常用的工具酶20DNA连接酶大肠杆菌NADT4噬菌体ATP来源辅基第二节分子克隆常用的工具酶21DNA连接酶功能1.修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键。2.修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键。3.连接多个平头DNA双链分子。第二节分子克隆常用的工具酶22从分子动力学的角底讲，由限制性内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末瑞则