DNA重排的检测方法

《DNA重排的检测方法》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、DNA重排的检测方法马欣荣高方远康海歧一、形态学观察二、细胞遗传学如：染色体核型分析、染色体显带等三、分子细胞遗传学如：荧光原位杂交四、分子生物学如：Southern杂交，PCR及相关技术等一、形态学观察例子：上个世纪40年代科学家B．McClintock观察研究玉米籽粒和叶子时发现有颜色变化。这种颜色变化是由遗传结构的基本改变引起的，从而导致转座子的发现。肿瘤细胞与正常细胞肿瘤细胞中基因重排现象非常普遍，遗传结构的改变引起表型的改变。因此从形态学上可以鉴定肿瘤。二、细胞遗传学染色体核型分析、染色体显带一个物种的染

2、色体核型及带型是稳定的染色体核型分析：观察中期染色体，初步分析染色体有无较大片段的缺失、断裂、易位、及附加常规核型分析荧光核型分析光谱核型分析(Spectralkaryotyping,SKY)光谱核型分析原理(Spectralkaryotyping,SKY)1996年Schroch等首次描述了SKY技术。应用5种荧光素同时标记24条人染色体，制成染色体涂染探针，应用Fourier光谱仪，CC成像和荧光显微镜进行检测分析，经计算成像处理，46条染色体形成具有不同颜色的核型影像,可用以分析各种染色体异常。优势：特异性和

3、分辨率比传统的显带技术高，它可以检测到1.5mb碱基的转位一次杂交即可分辨人的24条染色体人染色体光谱核型分析乳腺癌细胞染色体复杂的畸变2.染色体显带技术：C-banding主要染异染色质R-banding与C-banding相反，主要染常染色质区域G-banding是Giemsa染色结果，产生深浅不同的条带Q-banding是用喹丫因（quinacrine）染色得到的荧光条带，带型与G带相似G-带c.正常染色体末端缺失d.末端倒位末端单向易位e.着丝粒周倒位G－带显示人急性骨髓白血病异常染色体9、10、11染色体

4、间易位，右为异常染色体三、分子细胞遗传学原位杂交（Insituhybridisation）标记的核酸探针变性后与已变性的靶核酸在退火温度下复性，在不改变被分析对象，即维持其原位的前提下对靶核酸进行分析。2.荧光原位杂交Fluorescentinsituhybridisation(FISH)核酸探针用荧光染料标记，荧光信号通过显微镜观察。3.染色体涂染(Chromosomepainting)又称为多重荧光原位杂交(multiplex-fluorescenceinsituhybridisation,M-FISH)可同时

5、检测多个染色体，一次杂交即可检测人的24条染色体可检测简单及复杂的染色体重排荧光原位杂交，据标记物不同可分为：间接法：用生物素或地高辛标记探针，通过与荧光染料结合的抗生物素或抗地高辛抗体将信号放大而进行检测。直接法：直接用荧光素标记，如Vysis公司的FISH探针。荧光原位杂交原理示意荧光原位杂交过程急性骨髓白血病10、11号染色体间易位10、11号染色体易发生断裂的基因(MLL)位点小麦－簇毛麦F1代染色体间易位染色体涂染显示人染色体组荧光标记探针不对环境构成污染灵敏度能得到保障可进行多色观察分析，可同时使用多个

6、探针，缩短因单个探针分开使用导致的周期过长和技术障碍。4.比较基因组杂交ComparativeGenomicHybridization(CGH)原理：在荧光原位杂交基础上，结合消减杂交技术而发展起来的技术，主要用于肿瘤的检测及其基因组分析是由Kallioniemi等在1992年首先提出的，是检测整个肿瘤基因组DNA增加或减少的强有力的工具比较基因组杂交原理示意肿瘤DNA和对照DNA在染色体上的相对结合量取决于两种DNA标本中相应杂交序列的多少因此可根据不同荧光強度的比率而定量分析肿瘤基因組中DNA的增加或丟失等比混

7、合比较基因组杂交过程DAPI4’,6-二联脒-2-吲哚苯FITC异硫氰酸酯TRITC硫氰酸四甲基罗丹明人染色体不同荧光素染色结果数字化图像FITC/TRITC荧光强度比率分析图RatioimageFITC/TRITC应用：主要应用在检测肿瘤细胞的遗传变化物种间染色体同源性比较优势：可快捷检测中期、间期基因组不需预先知道DNA发生改变的部位一次实验即可检出待测样本整个基因组拷贝数的增减1.Southern-blotting应用于基因重排检测是1981年Korsmeyer等首先进行的。淋巴瘤DNA重排:将细胞DNA抽提

8、出来,用限制性内切酶进行酶切，胚系DNA就会产生特征性片段。但发生过基因重排的细胞DNA的酶切位点有所改变，会产生有别于胚系的DNA酶切片段。转膜后，与标记的DNA探针杂交，如有一定数量的克隆性增殖的淋巴细胞存在(>1~5%），克隆性的基因重排条带就可显示出来。对于正常或多克隆性的淋巴细胞增生，由于重排片段大小各异而显弥散带。四、分子生物学技术Figure5