DNA残留检测方法

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1、DNA残留检测方法比较及Threshold特点和优势主要内容DNA残留检测应用领域及其重要意义常用几种检测方法及其各自优缺点（光吸收、荧光法、杂交法、荧光定量PCR法）Threshold方法的原理和特点竞争分析总结©2011MolecularDevices,Inc.DevicesproductsareforResearchUseOnly.Notforuseindiagnosticprocedures.MolecularDevices,theMolecularDeviceslogo,andallothertrade

2、marksunlessotherwiseindicatedarethepropertyofMolecularDevices,Inc.DNA残留检测主要应用领域及其趋势1：随着生物医药技术发展，越来越多哺乳动物细胞生产治疗性疫苗和治疗性生物制品；2：中国市场目前现状©2011MolecularDevices,Inc.DevicesproductsareforResearchUseOnly.Notforuseindiagnosticprocedures.MolecularDevices,theMolecularDevicesl

3、ogo,andallothertrademarksunlessotherwiseindicatedarethepropertyofMolecularDevices,Inc.常见生物制品和对其外源DNA含量要求1：单克隆抗体（注射用抗人T细胞CD3鼠单抗）、重组蛋白质制品、疫苗（药典收录需要检测残留DNA的疫苗包括乙脑、狂犬、出血热、脊髓灰质炎、甲肝疫苗等）2：WHO、EU、FDA及SFDA等对外源DNA残留限量限定不同狂犬疫苗为例：如中国药典对ＤＮＡ残留限定在100pg/每人份剂量、脊髓灰质炎10pg/每人份剂量WHO最新

4、认定不高于10ng均为安全FDA限定为100pg/每人份剂量目前需要：稳定且灵敏度高的检测方法©2011MolecularDevices,Inc.DevicesproductsareforResearchUseOnly.Notforuseindiagnosticprocedures.MolecularDevices,theMolecularDeviceslogo,andallothertrademarksunlessotherwiseindicatedarethepropertyofMolecularDevices,Inc

5、.DNA残留检测重要性为什么要检测？？？细胞（Vero、CHO）培养产生的生物制品含有特定的杂质，会包括宿主细胞蛋白和DNA对人可能产生危害：残留外源DNA可能造成插入突变﹑导致抑癌基因失活﹑癌基因被激活等，最终造成疫苗使用者致癌；证实原代细胞为安全的©2011MolecularDevices,Inc.DevicesproductsareforResearchUseOnly.Notforuseindiagnosticprocedures.MolecularDevices,theMolecularDeviceslogo,an

6、dallothertrademarksunlessotherwiseindicatedarethepropertyofMolecularDevices,Inc.光吸收法检测DNA原理：DNA或者RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处DNA或RNA的浓度OD260=1.0相当于•50µg/ml双链DNA(dsDNA)•40µg/ml单链DNA/RNA•20µg/ml寡核苷酸(Oligos)优点：快速简便缺点：不能区DNA还是RNA、检测灵敏度不高、易受到杂质干扰（蛋白质或者盐类）©2011Mol

7、ecularDevices,Inc.DevicesproductsareforResearchUseOnly.Notforuseindiagnosticprocedures.MolecularDevices,theMolecularDeviceslogo,andallothertrademarksunlessotherwiseindicatedarethepropertyofMolecularDevices,Inc.荧光法检测DNA（2010版药典收录Picogreen）原理：荧光染料分子直接与双链DNA结合后，经带有荧光

8、功能的酶标仪激发后产生荧光信号•双链DNA(dsDNA)ExdsDNAPicoGreen(MolecularProbes)picogreenEm优点（与吸收光比）：特异性较好、具有一定程度耐盐，乙醇和蛋白干扰、检测灵敏度高（2010版中国药典给出数据：可达300pg左右，线性1.25-80ng/mlR>