叶绿体的荧光染色和观察

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1、【实验题目】叶绿体的分离与荧光观察【实验目的】1、通过对植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。 2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光3、熟悉荧光显微镜的使用方法。【实验材料与用品】1. 器材：离心机、组织捣碎机、天平、荧光显微镜、烧杯、量筒、胶头滴管、刻度离心管六层纱布，载玻片、盖玻片等 2. 材料：新鲜菠菜3.试剂：0.35 mol/L氯化钠溶液，0.01％吖啶橙(acridine orange)【实验原理】I.叶绿体分离的原理匀浆破碎细胞：利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒，收集类叶绿体大小的颗粒，得到叶绿体。差速离心:颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小

2、、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的黏度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和颗粒大小不同的颗粒其沉降速度也不同。依次增加离心力和离心时间，就能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。叶绿体的分离应在等渗溶液中进行（0.35mol/L氯化钠溶液或0.4mol/L蔗糖溶液），以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。分离过程最好在0-5℃条件下进行：如果在室温下，要迅速分离和观察。II.差速离心特点：介质密度均一，速度由高到低，逐级离心；用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器；沉降顺序：核---线粒体---溶酶体和过氧化物酶体---内

3、质网与高尔基体---核蛋白体，可将细胞器初步分离，常需要进一步通过密度梯度离心再进行分离纯化。III.荧光的概念光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态回到基态时，可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能，这种现象称为“光致发光”。紫外辐射、可见光以及红外辐射均可引起光致发光，如磷光和荧光。荧光：在光致发光中，如果一定波长的短波光（如紫外光）照射某种物质，这种物质吸收光能后进入激发态，并且立即退激发在极短的时间内能发射出比照射光波更长的光（如可见光），这种光就称为荧光，一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。荧光分为自发荧光或诱发荧光（次生荧光、续发荧光、间接荧光）。某

4、些物质受激发光照射后可直接发出荧光，如叶绿素、血红素的火红色荧光或木质素的黄色荧光等，称为自发荧光（直接荧光)，某些物质本身不发荧光，但它经荧光染料染色后，再通过紫外线照射同样也能发出荧光，这样的荧光称为诱发荧光，如叶绿体被吖啶橙染色后可发出桔红色荧光。荧光的性质1）吸收光，必须有激发光源2）荧光波长＞激发波长（损失热能）3）荧光强度极小于激发光的强度4）有不同程度的衰减（影响因素：如温度、光、淬灭剂等；先拍照后观察）5）荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率（在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片、盖玻片和无荧光油）吖啶橙（AO）1）探针特性：吖啶橙是三环杂芳香类荧光探针

5、，既可以标记DNA，又可以标记RNA，用蓝光激发后能够发出绿、红两种荧光。2）AO与核酸的结合分为强结合方式和弱结合方式两种：一种是嵌入核酸双链的碱基对之间，另一种是与单链核酸的磷酸发生静电间相互作用。3）强结合方式：又称插入性方式，AO分子插入在核酸双链的碱基对之间，它们的结合能量为6-10kcal/mol探针，插入后的探针分子与核酸结合的更加稳定。每插入一个AO分子，双链结构就发生26度旋转，这样在一个位点上就限制了AO分子的插入数目，每隔三个碱基插入一个AO分子。这种方式的结合，主要是AO分子与DNA的结合，其荧光发射峰为530nm,呈绿色荧光。4）弱结合方式：即静电吸引结合方

6、式，带正电荷的AO分子与带负电荷的磷酸根结合，每个磷酸根的位点上均可结合一个AO分子，最大结合率为1:1.这种结合方式主要是AO分子与RNA的结合，其发射波长为640nm,呈红色荧光。1）AO与核酸的结合方式在低浓度下最佳，此时插入性强结合方式占优势。④AO的主要作用1）对细胞内单链或双链RNA或DNA定性和定量2）分析核酸内部结构及含核酸的细胞成分构象3）观察DNA凝胶电泳情况4）作为胞内PH梯度显示剂，用来监测钠离子交换、钙离子诱导的质子梯度变化等。IV.荧光显微镜的操作及注意事项 1) 接通电源，打开启动装置开关 ； 2) 按starter按钮3-5秒以启动激发光源。注意sta

7、rter键不能超过5秒。启动2-3分钟后方可稳定，启动15分钟内不得关闭电源，一旦关闭汞灯，3分钟内不得重启，用完后关闭main switch； 3) 光路对中（换灯泡时进行）；4）选择相对应的激发虑片、阻断虑片和双色镜。5）放置样品，先在普通光镜下选择好要观察的视野； 6) 关闭普通光源后，撤开UV挡板，即可观察到样品的萤光情况7）需要照相时，要及时拍照，否则可能拍不到萤光照片； 8) 观察结束后，关闭mainswitch，切断电源。【实验步骤】一、具体