叶绿体的分离和荧光观察

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1、叶绿体的分离及荧光观察【实验目的】1.学习使用差速离心法获取叶绿体2.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。3.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。【实验原理】1.高等植物中叶绿体象双凸或平凸透镜，长径5—10um，短径2-4um，厚2-3um。高等植物的叶肉细胞一般含50-200个叶绿体，可占细胞质的40%。、叶绿体的数目因物种细胞类型，生态坏境，生理状态而有所不同。在藻类中叶绿体形状多样，有网状，带状，裂片状和星形等等，而且体积巨大，可达100um.叶绿体由叶绿体外被，类囊体和基质3部分组成。叶绿体含有3种不

2、同的膜：外膜，内膜，类囊体膜和三种彼此分开的腔：膜间隙，基质和类囊体腔。2.匀浆破碎细胞，利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒。收集类叶绿体大小的颗粒，得到叶绿体。差速离心法：颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部．分批收集即可获得各种亚细胞组分。叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变

3、使叶绿体受到损伤。分离过程最好在0—5℃的条件下进行：如果在室温下，要迅速分离和观察。3.差速离心法特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心用途：分离大小相差悬殊的细胞核细胞器沉降顺序：核——叶绿体，线粒体——溶酶体与过氧化物体——内质网与高尔基体——核蛋白体可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。【实验材料】1.试剂：0.35mol/L氯化钠溶液，0.01％吖啶橙。2.器具：粗天平、组织捣碎机、普通离心机、普通光学显微镜、荧光显微镜、500ml烧杯、量筒、滴管、10ml刻度离心管、纱布若干，试管架、无荧光载玻片和盖玻片。3.材料：新

4、鲜菠菜。【实验步骤】1.选取新鲜嫩滤菠菜叶，去除叶梗及粗脉，洗净擦干，称30g于150ml0.35mol/LNaCI溶液中；2.将叶和液同装入组织捣碎机中，匀浆3-5min，转速5000r/min；3.将匀浆液用6层纱布过滤到500ml烧杯中；4.取滤液4ml在1000r/min下离心2min；5.取上层清液在3000r/min下离心5min（沉淀为叶绿体和细胞核混合物）；6.将沉淀用2-3ml0.35mol/L氯化钠液悬浮；7.取一滴悬液滴片，加盖片后显微镜下观察。8.另取一滴悬液滴片，再滴加一滴0.01%吖啶橙荧光染料，混匀，盖上盖片后，在荧光显微镜下

5、观察。【实验结果】普通光学显微镜下对叶绿体的观察图表1普通光学显微镜下菠菜叶的叶绿体（10*40）普通光学显微镜下可看到：菠菜叶绿体呈绿色的橄榄形因为离心不当，带有一定量的杂质图表2普通光学显微镜下叶绿体局部放大图（10*40）仔细观察可看到基粒——深绿色的小颗粒荧光显微镜下的叶绿体图表3荧光显微镜下未被染色的叶绿体（10*40）荧光显微镜下可观察到：未被染色的叶绿体自发荧光为火红色，呈点状分布，其他部分为黑色。图表4荧光显微镜下已被染色的叶绿体（10*40）吖啶橙染色后荧光显微镜下，对叶绿体的观察：叶绿体可发出桔红色荧光。其中混有的细胞核则发绿色荧光其他

6、大部分，背景为绿色。【实验结果分析】1.普通光学显微镜下观察到的叶绿体呈绿色橄榄形，高倍镜下仔细观察可看到叶绿体内部含有深绿色的小颗粒——基粒。另外还可以观察到形状较小且不规则的组织碎片，这是因为在离心过程中，因为离心不彻底造成叶绿体沉降物中含有其他组织碎片。2.荧光显微镜下，叶绿体自发荧光为“火红色”，次生荧光为“桔红色”。3.未染色的玻片在荧光显微镜下观察，叶绿体为“火红色”，呈点状分布，且背景为黑色。这是因为叶绿体自身在悬液中呈点状分布，并且其中的叶绿素在经过激发光波照射后，可放出火红色的自发荧光，并且悬液中的其他成份不发生荧光反应4.染色后的玻片在

7、荧光显微镜下观察，叶绿体为“桔红色”，其中混有的细胞核碎片中含有的核酸在吖啶橙的作用下呈绿色。背景空白处为绿色，这是因为载玻片有杂质。【实验注意事项】1.荧光显微镜有两套光源系统，先在自然光源下调整好观察视野，再切换到荧光光源观察。1.要注意正确的使用荧光显微镜：（1）不要直接观察激发光源，保护眼睛（2）荧光染料有一定毒性，要做好防护（3）观察荧光受多种因素的影响，如温度、光、淬灭剂等（4）在荧光观察时应抓紧时间，立即拍照，防止荧光会发生淬灭，造成整体发红。（5）荧光显微镜不能随意开关，汞灯开启15分钟之内不能关闭。2.叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35m

8、ol/LNaCl）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受损伤；3.制作