实验二：叶绿体的分离与荧光观察

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1、实验二叶绿体的分离与荧光观察细胞生物学实验实验目的1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。实验原理细胞器分离的过程包括两个主要阶段：破碎细胞和细胞组分的分离在等渗溶液中进行组织匀浆、分离叶绿体的分离采用差速离心或密度梯度离心法进行利用荧光显微镜观察叶绿体的自发荧光和间接荧光（次生/诱发荧光）常用的细胞破碎方法方法技术原理效果成本举例机械法匀浆法细胞被搅拌器劈碎或受剪切力而破碎适中适中动植物组织或细胞研磨法细胞被研磨物磨碎适中便

2、宜植物组织超声波法用超声波的空穴作用使细胞破碎剧烈昂贵细胞悬浮液小规模处理珠磨破碎法细胞被玻璃珠或铁珠捣碎剧烈便宜细胞悬浮液和植物细胞大规模处理化学法渗透冲击渗透压破坏细胞温和便宜血红细胞的破坏酶消化法细胞壁或细胞膜被消化，使细胞破碎温和昂贵动植物细胞增溶法表面活性剂溶解细胞膜温和适中破碎大肠杆菌脂溶法有机溶剂溶解细胞壁适中便宜甲苯破碎酵母细胞碱处理法碱的皂化作用使细胞壁溶解剧烈便宜破碎大肠杆菌离心分离技术离心是分离细胞组分和生物大分子最常用的分离方法，因为不同的细胞器和分子有不同的体积和密度，可在不同离心力不

3、同介质沉降分离。分离各种细胞组分的方法主要有：差速离心密度梯度离心速率-区带梯度离心等密度离心差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。差速离心的分辨率不高，沉降系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取密度梯度离心用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞匀浆液混悬或置于介质

4、的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞器分层、分离的方法。这类分离又可分为速率-区带梯度离心和等密度梯度离心两种。优点是一次离心可分离提纯样品中几种组份，用于较精细的分离。速率-区带梯度离心和等密度梯度离心原理：根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，通过离心力场的作用，使不同的颗粒在密度梯度层内形成一系列区带，从而达到彼此分离的方法。A、速率-区带梯度离心流程图B、等密度梯度离心流程图原理：根据不同颗粒在密度梯度介质中存在着浮力密度差，在离心力场作用下，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰

5、好相等的位置上形成区带，从而使不同浮力密度的颗粒得到分离的方法。两种密度梯度离心方法的异同特点速率-区带梯度离心等密度离心分离方法的主要依据主要依赖分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同依赖于样品颗粒的不同密度来进行离心分离的介质密度梯度选择最大密度必须小于样品中粒子的最小密度；梯度平缓覆盖了待分离物质的密度；梯度陡度较高离心介质的主要作用减缓颗粒扩散速度阻止颗粒移动；筛选与分离颗粒分辨率范围沉降系数相差～20%的物质颗粒密度差异大于1%离心后区带形成位置易变(样品易扩散）不变（样品不扩散）影响样品区带形成的主要因

6、素离心时间（过长或过短都不利）颗粒样品密度一般操作方法介质梯度应预先形成，离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面，离心后形成区带。介质梯度不需预先制备，离心时把密度均一的介质液和样品混合后装入离心管，通过离心自形成梯度，让颗粒在梯度中进行再分配。常用介质蔗糖、甘油蔗糖、甘油、CsCl、硫酸铯、溴化铯、三碘苯衍生物等。表1:各种亚细胞构造在不同的离心介质中分离所需的离心力与时间结构差速离心(在0.25M蔗糖溶液中)速率-区带梯度离心(5～50%蔗糖)等密度离心(其他介质,如CsCl等)细胞核800-1000g×1

7、0min500g×10min4000g×60min线粒体10,000g×20min5000g×10min80000g×100min溶酶体10,000g×20min5000g×10min80000g×100min质膜(大片)100,000g×15min～100,000g×100min～150,000g×600min内质网片段150,000g×40min1000g×20min100,000g×200min微粒体100,000g×60min10,000g×30min100,000g×360min小颗粒100,000g

8、×60min各种细胞器、大分子和病毒的密度及相应的沉降系数图:各种细胞器、大分子和病毒的密度及相应的沉降系数根据1924年Svedberg（离心法创始人--瑞典蛋白质化学家）对沉降系数下的定义：颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。以每单位重力的沉降时间表示，并且通常为1～200×10-13秒范围，10-13这个因子叫做沉降单位S,即1S=10-13秒看图思考：要将细胞匀浆液中的得到更纯