微生物的纯培养及显微技术

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1、Chapter2微生物的纯培养及显微技术Sect1微生物的分离和纯培养一、前言二、微生物操作基本技术——无菌技术三、微生物的分离和纯培养四、微生物的保藏技术一、前言1、微生物研究对象：群体2、研究基础：1）纯培养技术：把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的技术。●培养物：在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物。●纯培养物：只有一种微生物的培养物。2）显微技术：包括显微标本的制作、观察、测定、分析和记录。培养基二、微生物操作基本技术——无菌技术1、微生物培养的常用器具及其灭菌1）

2、常用器具：试管、玻璃烧瓶、平皿、接种环（针）、无菌操作台、酒精灯等2）灭菌：●灭菌(sterilization)：杀灭物体上所有微生物的方法。即采用强烈的理化因素使任何物体内、外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。它比消毒要求高，包括杀灭细菌芽胞在内的全部病原微生物和非病原微生物。如高温、辐射、超声波和激光等。●消毒(disinfection)：杀死物体上病原微生物的方法，并不一定能杀死含芽胞的细菌或非病原微生物。即仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的生物基本无害的措施用以消毒的

3、药品称为消毒剂(disinfectant）●抑菌(bacteriostasis)：抑制体内或体外细菌的生长繁殖。常用的抑菌剂为各种抗生素。●防腐(antisepsis)：利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖而对被消毒的物体基本无害的措施。如低温、缺氧、干燥、高酸、高渗或防腐剂。细菌一般不死亡。●无菌(asepsis)：不存在活菌。（1）常用物理消毒灭菌方法●热力灭菌法；●辐射杀菌法；●滤过除菌法；●超声波杀菌法。A、热力灭菌法●干热灭菌法▲焚烧：废弃物、尸体；▲灼烧：接种环、试管口；▲干烤：玻璃器皿；

4、▲红外线：医疗器械。●湿热灭菌法Ⅰ）常压下：●巴氏消毒法：61.6-62.8℃30min或71.7℃15-30s,主要用于牛乳消毒。●煮沸法；巴氏消毒的方法有几种？一种是将牛奶加热到62-65℃，保持30分钟。这种方法目前在广东较少使用。采用这一方法，可杀死牛奶中各种生长型致病菌，灭菌效率可达97.3%-99.9%，经消毒后残留的只是部分嗜热菌及耐热性菌以及芽孢等，但这些细菌占多数的是乳酸菌，乳酸菌不但对人无害反而有益健康。第二种方法将牛奶加热到75-90℃，保温15-16秒，其杀菌时间更短，工作效率更高。但

5、杀菌的基本原则是，能将病原菌杀死即可，温度太高反而会有较多的营养损失。●间歇蒸汽消毒法：80-100℃15-60min,37℃过夜，循环三次。主要适用于不耐热培养基灭菌。Ⅱ）加压下：●连续加压灭菌：135-140℃下处理5-15s，主要适用于大规模的发酵工厂培养基灭菌；●常规加压灭菌：121℃（压力：1kg/cm2或15磅/英寸）15~20min，是一种最为广泛的灭菌方法。▲注意灭菌物体含菌量的影响，含菌量越高灭菌时间越长。天然原料＞化学试剂▲空气的排除程度，必须尽量驱尽锅内空气。是依靠温度而不是压力来达到灭

6、菌的目的。15磅/英寸：纯蒸汽121℃；排除1/2空气：112℃；不排除空气：100℃。灭菌锅▲灭菌对象体积；50ml(12min),2000ml(30min)▲灭菌对象pH值：pH＜6.0最易死亡；而pH6.0~8.0时，微生物最不易死亡。▲加热与散热的速度。B、辐射杀菌法；●紫外线：波长200-300nm的紫外线具有杀菌作用。其主要作用于DNA，使一条DNA链上相邻的两个胸腺嘧啶共价结合形成二聚体，导致细菌变异和死亡。●电离辐射：高速电子、X射线、γ射线洁净工作台●微波：波长1mm~1mC、过滤除菌法●赛

7、氏滤器；●玻璃滤器；●薄膜滤器D、超声波杀菌法●是一种机械的作用因素，每秒超过2万次振动的声波即为超声波。常用的超声波发生器能产生20-100千赫的声波。可使细菌细胞壁裂解而死亡。超声仪（2）化学消毒剂：●消毒剂的种类：酚类、醇类、重金属盐类、氧化剂、表面活性剂、烷化剂。●消毒剂的应用：病人排泄物与分泌物、皮肤、粘膜、饮水、厕所、空气、手。3）接种操作●用接种环或接种针分离分离微生物或在无菌条件下把微生物由一个培养皿转接到另一个培养皿进行培养。图-2-1无菌操作转接培养物无菌操作箱紫外照射30min以上；靠近

8、火焰。三、微生物的分离和纯培养●菌落：单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。●菌苔：许多菌落连成一片称为菌苔。●培养基：培养微生物的营养物质。常用的有：肉汤、LB培养基等。●固体培养基：用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基。常用1.5%琼脂。●平板：即培养平板的简称，它是指熔化的固体培养基倒入平皿冷却凝固后，盛有固体培养基的