透射电镜样本的制备

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1、透射电镜样本的制备超薄切片制样负染超薄切片由于电子的穿透能力弱，一般的组织细胞的切片，无法在电镜下获得清晰的图像。阻碍了电子显微镜的发展。1957年，英国Huxley发明超薄切片机。超薄切片制片过程取材固定脱水浸透包埋切片染色取材快迅速放入固定液中小0.5-1mm3冷低温操作准取材部位准确避免机械损伤净少带血液及组织液取材具体方法将动物麻醉或急性处死，暴露的所需脏器。用锋利剪刀剪下一小块组织，放到滴有预冷固定液的蜡片上。将组织切成细长条，再将其切成小块（1mm3）。将小块移至装有预冷固定液的清洁小瓶内。若组织块带有血液而使小瓶内固定液浑浊，应更换新鲜固定液，然后置

2、于4℃冰箱内固定。固定目的：尽可能完整保存细胞在活体状态时的超微结构细节，避免自身酶的分解而出现自溶，或因外界微生物的侵入繁殖而产生腐败，致使细胞的超微结构遭受破坏。同时使细胞内的各种成分固定下来，避免在以后的冲洗和脱水时溶解和流失。固定方法化学固定：浸泡固定，原位固定，灌注固定物理固定：冷冻固定，微波固定，临界点干燥固定灌注固定通过血液循环的途径将醛类固定液灌流到所要男友定的组织中，待组织适度硬化后，切取所需组织。此法固定迅速而均匀，可同时保存酶的活性和组织超微结构。适用于取材柔软组织或难以浸透、死后变化快的组织和器官，如对中枢神经系统、视网膜和肾脏等组织的固定

3、。理想固定剂能迅速均匀的渗透到组织结构内稳定细胞各种结构成分，不致溶解和丢失对细胞超微结构没有损伤，保证电镜图像的真实性能供细胞化学测定并能增强图像反差能保留细胞的抗原性，一定的酶活性常用固定剂戊二醛优：渗透能力强，组织块可长期保存，能固定核酸，安全。缺：没有电子染色作用。锇酸优：能与蛋白质、脂类结合形成密度，可以电子染色缺：渗透能力弱，不能固定核酸、糖原，有剧毒固定方法——戊二醛-锇酸双固定先用2.5%戊二醛固定2h以上。缓冲液多次清洗（pH7.40.2mol/L磷酸缓冲液洗三次，15min/次）。1%锇酸固定2h。清洗组织在固定后，应用清洗液洗去残留的固定液残

4、留的醛可与锇酸反应产物细的电子致密的还原锇。锇酸可与乙醇作用生成沉淀。清洗液采用与固定液同系列的缓冲液。（磷酸缓冲液，二甲砷酸钠缓冲液）脱水含水样品在电镜高真空状态下观察反差极低常用包埋介质与水不互溶，将细胞内的游离水分除去后，包埋介质才能均匀地渗透到组织内部去除样品中的水，为包埋剂的均匀浸透做准备常用脱水剂乙醇，与环氧树脂的互溶性差，需用环氧丙烷作为中间溶剂进行转换。丙酮市售的无水丙酮含少量水分，可加入无水硫酸钠或硫酸铜等干燥剂吸去水分。脱水100%丙酮H2O50%丙酮H2O90%丙酮H2O70%丙酮15min15min15min20min20min浸透和包埋通

5、过脱水剂稀释包埋剂，最终让包埋剂逐渐取代脱水剂，使其渗透到组织细胞中去以包埋剂完全浸透到组织内部，经加温逐渐聚合成坚硬的固体，成为细胞结构的支架，能够承受切片时的各种力的作用，有利于超薄切片。丙酮：包埋剂2：137℃1h丙酮：包埋剂1：137℃1h纯包埋剂37℃1h包埋37℃过夜，45℃24h，65℃24h理想包埋剂聚合前的单体呈低粘度液体，能较快渗入组织能经受电子轰炸，高温下不易升华和变形透明度好，高倍放大不显示结构，不产生背景反差聚合均匀充分，聚合前后体积变化小，组织无变形，微细结构保存良好软硬度适中并易于调整Epon812：环氧树脂包埋剂。淡黄色液体，黏度较

6、低，易渗入组织，对细胞结构保存好，在配制时需充分搅拌。聚合后成为具有稳定三维空间结构的固体。Epon812DDSA（十二烷基琥珀酸酐）固化剂：控制软度MNA（甲基内次甲基邻苯二甲酸酐）固化剂：控制硬度DMP-30（2,4,6三，二甲氨基甲基苯酚）加速剂包埋剂配方季节配比包埋液成份5mL10mL20mL30mL40mL50mL春秋Epon8122.4954.999.9814.9719.9624.95DDSA0.621.242.483.724.966.2MNA1.8853.777.5411.3115.0818.85DMP-300.0850.170.340.510.68

7、0.85夏Epon8122.575.1410.2815.4220.5625.7DDSA0.310.621.241.862.483.1MNA2.124.248.4812.7216.9621.2DMP-300.0850.170.340.510.680.85冬Epon8122.4254.859.714.5519.424.25DDSA0.9251.853.75.557.49.25MNA1.653.36.69.913.216.5DMP-300.0850.170.340.510.680.85包埋板切片修块切片超薄切片机机械推进式：通过微动螺悬及微动杠杆使标本臂向刀刃作微小推进

8、。热胀冷缩