淡水湖泊中类蛭弧菌的分离方法

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1、第30卷第1期矿物学报Vol.30，No.12010年3月ACTAMINERALOGICASINICAMar.，2010文章编号:1000-4734(2010)01-0077-06淡水湖泊中类蛭弧菌的分离方法1，21*1，2曾佳，梁小兵，陆婷(1.中国科学院地球化学研究所环境地球化学国家重点实验室，贵州贵阳550002;2.中国科学院研究生院，北京100039)摘要:从贵州阿哈湖、百花湖及云南滇池不同深度的湖水中筛选出2株宿主菌株。经16SrRNA基因序列分析，这2株宿主菌分别鉴定为肠杆菌(Enterobacteriales)和黄色单胞菌(Xant

2、homonadales)。分别利用这2株宿主菌，从湖水样品中获得到了类蛭弧菌噬菌斑。通过吸光度分析、用淡水类蛭弧菌的特异性引物进行基因扩增、DNA序列分析等一系列方法，证实了所分离的菌株为类蛭弧菌。建立了用同一生长环境中的宿主菌来分离类蛭弧菌的方法，并用该方法从淡水湖泊中分离出了不同类群的类蛭弧菌菌株。关键词:类蛭弧菌;分离;宿主菌;PCR;DNA序列分析中图分类号:Q939.99;X172文献标识码:A作者简介:曾佳，男，1976年生，硕士研究生，从事环境与生物地球化学的研究工作.E-mail:zjbioch@163.com［7-10］类蛭弧菌［

3、Bdellovibrio-and-likeorganisms法。人们通常采用副溶血弧菌菌株P-5、鳗弧［8，11-12］(BALOs)］为革兰氏阴性、捕食性细菌，影响其它菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、大肠杆菌作细菌的致死率，如环境中的致病菌副溶血弧菌、创为宿主来对类蛭弧菌进行分离培养。以上细菌虽伤弧菌和霍乱弧菌等。1962年首次报道发现了能有效地分离类蛭弧菌，但这些宿主菌不一定是［1］蛭弧菌。目前将与蛭弧菌具有相似生活特性所研究环境中的优势菌，在研究类蛭弧菌与其所的一类细菌称为“类蛭弧菌”。根据耐盐性，将蛭处环境之间的相互关系时，没有太大的说服力。弧

4、菌分为2大类，淡水(或陆地)类群与海洋(或为了研究类蛭弧菌的生态和地球化学功能，我们［2-4］噬盐)类群。我国现阶段对类蛭弧菌的研究直接从所研究的环境中分离出宿主菌，而不是采主要集中在海洋类群，对淡水类群却很少涉及。用从其他环境中分离出来的已知的宿主菌来分离实际上，淡水湖泊中的类蛭弧菌无论在水产养殖、类蛭弧菌。这样更能反映环境中类蛭弧菌及其被环境治理方面都有很大的潜在价值，需要我们去捕食细菌之间的相互关系。通过对阿哈湖、百花发掘。在本次实验中，我们从贵州阿哈湖、百花湖湖及滇池湖水中类蛭弧菌分离培养和鉴定的研和云南滇池三个淡水湖泊中分离类蛭弧菌进行究

5、，证明这是一种研究环境中类蛭弧菌的有效研究。方法。从不同环境中分离类蛭弧菌然后作进一步的1实验方法研究，是目前研究类蛭弧菌最普遍的研究步骤。类蛭弧菌的分离培养方法有多种，例如将宿主菌1.1样品采集［5］和样品充分混合后直接在培养基上凃布;也可以将宿主菌液先均匀凃布在培养基上后再将样品第一次样品采集分离被捕食细菌:分别从阿［6］点样于其上;但最常用的是双层琼脂平板培养哈湖、百花湖和滇池采集表层水用于分离宿主菌。第二次样品采集:用已分离的宿主菌来分离样品中的蛭弧菌。从上述三个湖泊中(图1)采集表收稿日期:2009-06-16层、中层和底层水湖水(水深不

6、足3m只采集表层基金项目:贵州省科学技术基金(20092040);国家自然科学基金项目(40473050);国家重大基础研究项目(2006CB4003200)和底层水或者只采集表层水)。每个采样点采集*通讯作者，E-mail:liangxiaobing@vip.skleg.cn2个平行样。78矿物学报2010年图1阿哈湖、百花湖和滇池采样点Fig.1.ThesamplingstationsinLakeAha，BaihuaandDianchi.中，冷凝。上层胶先加热融化后置于47℃恒温水1.2宿主菌的分离培养浴。在3.5mL上层胶中加入4.5mL水样

7、、0.50-1宿主菌Ⅰ的分离:水样梯度稀释至10、10、mL宿主细胞，混均后倒于下层胶上，25℃培养至-2-3-410、10和10倍。分别凃布在富集培养基上，25有透明噬菌斑生成。℃培养至形成菌落。富集培养基组成:蛋白胨10(2)液体培养:宿主菌固体培养长出菌苔，加g，酵母浸汁5g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸馏水15mL灭菌蒸馏水收集宿主菌悬液。然后取30mL［6］L。调节至pH8.0。含3.94mg/LCaCl2·H2O，203.3mg/LMgCl2·0-1宿主菌Ⅱ的分离:水样分别稀释至10、10、6H2O的无菌水于三角瓶中。加入0.5mL宿主

8、细-2-3-410、10和10。分别凃布在培养基上，25℃培胞悬液，挑取单个噬菌斑加入三角瓶中。在25℃养至形成菌落。培养