蛭弧菌BDE-1的分离纯化、生物特性及促进其蛭质体形成的研究

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1、IsolationandCharacterizationofaBdellovibrio-andlikeorganismstrainBDE-1andPromotionofitsBdelloplastformationADissertationSubmittedfortheDegreeofMasterCandidate：LiMinjiaSupervisor：Prof.CaiJunpengSouthChinaUniversityofTechnologyGuangzhou,China分类号：Q939.9学校代号：10561学号：201520120470华南理工大学硕士

2、学位论文蛭弧菌BDE-1的分离纯化、生物特性及促进其蛭质体形成的研究作者姓名：李敏佳指导教师姓名、职称：蔡俊鹏教授申请学位级别：硕士学科专业名称：食品科学与工程研究方向：水产养殖益生菌论文提交日期：2018年04月18日论文答辩日期：2018年06月04日学位授予单位：华南理工大学学位授予日期：年月日答辩委员会成员：主席：张学武委员：魏东、陈谷、蔡俊鹏、范晓丹摘要蛭弧菌类群(Bdellovibrio-and-likeorganisms，BALOs，以下简称蛭弧菌)是一类寄生型细菌，是众多益生菌中的一类较新成员。作为具有捕食特性的寄生型细菌，蛭弧菌因其裂解谱广，

3、裂解致病性细菌的能力强而有着十分广阔的潜在应用前景。由于蛭弧菌特殊的繁殖方式和周期，它的应用受其活性高低的影响，因而维持或者提高蛭弧菌微生态制剂的活性是应用关键。为了筛选出能够裂解枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的蛭弧菌株，以增进其益生性能；研究提高蛭弧菌的蛭质体密度，以利于保存，本实验以有益菌枯草芽孢杆菌作为蛭弧菌的寄生宿主，采用稀营养肉汤(Dilutenutrientbroth，DNB)双层平板法成功从海南海水泥样中分离筛选出一株能够裂解枯草芽孢杆菌的蛭弧菌，并对该株蛭弧菌进行纯化培养至其在DNB双层平板上长出的噬菌斑呈透明圆形、大小几乎保

4、持一致为止。然后对目标菌株进行了透射电镜形态观察和16SrRNA基因序列分析，确认该新分离菌株为蛭弧菌，并命名为蛭弧菌BDE-1。为了获得蛭弧菌BDE-1的最佳发酵条件进而获得高密度的蛭弧菌发酵液，本实验进行了一系列单因素实验，不仅对BDE-1进行了生物特性分析(温度、盐度和pH)，也研究了宿主菌的添加密度和谷氨酸钠的添加浓度对蛭弧菌BDE-1繁殖密度的影响。研究后发现，蛭弧菌BDE-1在温度为25ºC，盐度为20‰，pH为7.0，宿主菌添加密度为111×10CFU/mL，谷氨酸钠添加浓度为5mmol/L的条件下的增殖密度最大。为了解蛭弧菌BDE-1的裂解谱和

5、裂解能力的强弱，本实验研究了BDE-1对28株受试宿主菌的裂解情况和对2株黄绿弧菌的消除效果，还研究了宿主菌的存活状态对BDE-1生长的影响。研究发现，蛭弧菌BDE-1可裂解24株试验菌，占总试验菌株数(28株)的85.7%，其中对试验弧菌(13株)的裂解率达92.3%；蛭弧菌BDE-1对2株黄绿弧菌具有一定的消除效果，对黄色弧菌、绿色弧菌和黄绿弧菌混合3种类型弧菌的消除效果有显著性差异(p<0.05)，而且对这3种类型弧菌的消除能力表现为黄绿弧菌混合>黄色弧菌>绿色弧菌；宿主菌的存活状态对BDE-1生长繁殖并无较大影响，它能够利用灭活宿主菌的细胞基质进行发育

6、繁殖。为了解蛭弧菌BDE-1生长发育过程中蛭质体的密度和稳定性，本实验通过单因素2+2+实验研究了吲哚、氨苄青霉素、放线菌酮、Ca和Mg5种影响因子对蛭弧菌BDE-12+2+蛭质体的形成及稳定性的影响。研究发现，吲哚、氨苄青霉素、Ca和Mg对促进蛭弧I菌BDE-1蛭质体的形成和稳定具有重要作用，这4种影响因子对BDE-1蛭质体的最佳作用浓度分别为：3mmol/L、150μg/mL、20mmol/L、和2mmol/L；放线菌酮不仅对BDE-1蛭质体的形成无促进作用，反而对其生长发育具有抑制作用，在高浓度的放线菌酮作用下甚至还会导致蛭弧菌BDE-1菌体的死亡。以上

7、研究结果为维持或提高蛭弧菌微生态制剂的应用活性提供了理论依据，具有重要的意义和价值。关键词：蛭弧菌；分离鉴定；条件优化；裂解性能；蛭质体形成IIABSTRACTAsarelativelynewmemberofpredatorymarineprobiotics,Bdellovibro-andlikeorganisms(BALOs)haveawideapplicationprospectbecauseofitswidespectrumofcrackingandstrongabilitytolysepathogenicbacteria.However,because

8、ofBALOs’specialrepr