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1、噬菌蛭弧菌的分离培养研究【关键词】水蛭弧菌；弧菌，副溶性；双层培养法；聚合酶链反应蛭弧菌（Bdellovibro，简称BD）是革兰阴性细菌，并可以通过裂解其寄生的革兰阴性细菌维持自身的生长发育[1]。目前，对蛭弧菌的研究主要集中在海水中，对淡水中的研究则很少。本实验利用普通蛋白胨培养基和营养肉汤两种培养基，采用描点法[2]、单层培养法[3]及双层培养法[4]，对淡水环境中的噬菌蛭弧菌样品进行分离培养，以期找出最适合的培养方法及培养基。 1材料与方法 1.1原料 淡水样品采自阿哈湖水库，梯度稀释至10-3倍。蛋白胨培养基（Pp20）下层板(固体):1g蛋白胨,15g琼脂,1L
2、蒸馏水；Pp20上层板(半固体):1g蛋白胨,7g琼脂,1L蒸馏水。营养肉汤培养基：蛋白胨5g，牛肉浸汁3g，蒸馏水1L稀释500倍备用[4]。上层胶：NB×500培养液2ml，CaCl2·H2O3.94mg,MgCl2·6H2O203.3mg，琼脂7g，加蒸馏水至1000ml，调节至pH8.0；下层胶：NB×500培养液2ml，CaCl2·H2O3.94mg,MgCl2·6H2O203.3mg，加蒸馏水至1000ml，琼脂15g，调节至pH8.0。宿主菌：副溶血弧菌购于中国科学院菌种保藏中心。引物：正链CAGGCCTAACACATGCAAGTC，负链CGWCACTGAAGGGG
3、CAA[5～7]。94℃,4min,94℃,1min,56℃,1min,72℃,1min,72℃,5min,4℃,∞。 1.2方法 描点法:将宿主菌分别涂布在蛋白胨培养基（固体）和营养肉汤培养基（下层胶）上，用毛细吸管蘸一下样品，点样于在培养基不同位置。单层涂布法：将宿主与样品混合，摇匀后直接涂布在蛋白胨培养基（固体）和营养肉汤培养基（下层胶）上。双层平板培养法：首先将蛋白胨培养基（固体）和营养肉汤培养基（下层胶）倒平板、凝固，将0.5ml宿主，5ml样品和5ml上层胶充分混合，倒在下层胶上。3种方法点样后30℃培养2～3d，观察噬菌斑的生成并计数。3种培养方法各做3份，分别
4、编号1、2、3。 1.3噬菌蛭弧菌的检测 收取生成的噬菌斑，用16SrRNA基因特异性探针作引物进行PCR扩增，检测所得的细菌是否噬菌蛭弧菌。 2结果 2.1噬菌斑 描点法点样后培养2～3d，并无明显的噬菌斑生成。单层涂布法培养2～33d后，在营养肉汤培养基上看到少数几个小噬菌斑生成，噬菌斑形状不规则（图1）；而在蛋白胨培养基上未见噬菌斑的生成，双层培养法蛋白胨培养基上有明显的、大块的、圆形和不规则斑点（图2），在营养肉汤的双层培养基上也可看到有圆形，透明的噬菌斑产生，数量较多（图3,表1），但小于双层蛋白胨培养基上的斑块。表13种培养方法生成的噬菌斑数（略） 2.2
5、PCR扩增检测 用16SrRNA基因特异性探针作引物来进行PCR扩增，发现在蛋白胨培养及营养肉汤单层涂布法所得的斑点中所提取的细菌不能得到扩增条带，而用营养肉汤培养的噬菌斑中可以得到蛭弧菌（图4）。 3讨论实验结果表明，只有用营养肉汤双层培养后的活菌计数才能得到有效数字[8]。用描点法无法得到噬菌斑，这可能是由于所取样品量太少，蛭弧菌的浓度太低而无法形成明显的噬菌斑。双层培养法可以有效地分离出蛭弧菌，可能因为双层培养能给宿主和蛭弧菌一个更为稳定的生长环境，而且营养肉汤培养基的效果更好，可能由于培养基中牛肉浸汁和一些离子存在，不仅能使蛭弧菌得到培养，同时使宿主菌得到增长，为蛭孤
6、菌生长提供优质的营养环境，故认为营养肉汤双层培养是培养淡水蛭弧菌的最适方法。【参考文献】 [1]WilliamsHN,FaklerWAJ,ShayDE.IncidenceofmarineBdellovibrioslyticagainstvibrioparahaemolyticusinchesapeakebay[J].ApplEnvironMicrobiol，1980(40):970-972. [2]沈萍，范秀荣，李广武．微生物学实验［M］．北京：高等教育出版社，1999:97. [3]崔思列，班进林，杨润德，等．蛭弧菌的分离培养及其对病原菌噬菌作用的初步研究[J]．河北农业
7、大学学报,1991(14)：76-81． [4]KovalSF.Thesearchforhunters:Culture-dependentand–IndependentmethodsforanalysisofBdellovibrioandlikeorganisms[J].MicrobiolMonogr(publishedonline),2006(27)：191-211. [5]KovalSF.Thesearchforhunters:culture-dependentandin
