用突起切断法分析MPP +对于多巴胺能神经细胞的损伤

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1、生物物理学报第十四卷第二期一九九八年六月ACTABIOPHYSICASINICAVol.14No.2Jun.1998+*用突起切断法分析MPP对于多巴胺能神经细胞的损伤1,2123蔡东王晓民瞿安连韩松平1221**于英心周专康华光韩济生(1北京医科大学神经科学研究中心北京100083)(2华中理工大学生物物理与生物化学研究所武汉430074)(3Dept.ofPharmacol.andPhysiol.Sci.,St.Louis.UniversitySchoolofMed.,St.Louis,MO6310

2、4,USA)摘要对神经细胞在电压钳制方式下进行膜片钳记录受到胞体和突起空间钳位不一致的限制。本文+尝试用突起切断方法区分胞体与突起的电压门控型钙电流,并据此对MPP引起的钙电流变化进行分析。实验结果表明,突起上的电压门控钙通道的最大激活电压约为+30mV,而胞体的则为-+10～10mV左右;MPP损伤多巴胺能神经细胞后可导致电压门控型钙电流的抑制,这一抑制的+I-V特性与突起钙电流I-V非常相近。由此提示,MPP对于多巴胺能神经细胞的损伤更集中于其突起纤维。+关键词:MPP神经元空间钳位钙电流膜片钳以全

3、细胞膜片钳技术研究完整神经细胞的膜通道时通常存在对突起部位的空间钳位问题。这阻碍着分别研究神经元突起与胞体的电生理特性。如果某种药物对于神经细胞的作用存在部位差异,按常规进行的全细胞膜片钳记录就有困难。本文尝试用突起切断方法解决这一矛盾。+1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridium,MPP)是外源性毒素N-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)在神经组织中被氧化产生的毒

4、性基团。它被中脑多巴胺能神经元特异性摄取,从胞内[1]损伤细胞,最终导致人和动物产生帕金森氏病(Parkinson'sDisease,PD)样症状。其毒性+[2,3]机理中对于MPP最先损伤突起还是胞体尚有争议,并缺乏相应的电生理证据。本文亦对此进行初步分析。1材料与方法1.1细胞培养[4]细胞采用多巴胺能神经细胞系MN9D,其培养基为DMEM(sigma),附加10%FBS,280U/ml青霉素和链霉素,pH7.3。传代前将涂以poly-(D)-lysine的盖玻片(0.5×0.5cm)数块放入35m

5、m培养皿中。控制细胞传代密度为70,000/皿,培养液中加入分化剂丁酸钠*国家自然科学基金(39480008,69571014),国家杰出青年科学基金(39525009),国家教委跨世纪优秀人才计划**与北美医学基金会资助。通讯联系人。©1995-2007TsinghuaTongfangOpticalDiscCo.,Ltd.Allrightsreserved.228生物物理学报1998年(sodiumbutyrate,1mM)。于37℃,10%CO2孵箱中培养至6-8天,隔天换液。以下除特殊说明,实验所

6、用MN9D细胞为分化细胞。1.2实验溶液[5,6]为尽可能减少电极内液对胞内成分尤其是线粒体造成的不利影响,依文献选择电极内液。其成分为(mmol/L):Cs2SO475;CsCl15;NaCl6.5;Sodiumpyruvate2.5;L-(-)-malicacid2.5;NaH2PO41;MgSO41;HEPES50;MgATP5;GTP0.3;leupeptin0.1;cAMP0.5;用CsOH校定pH为7.3;用glucose调节渗透压至307mOsm/kgH2O。细胞外液的成分为(mmol/L

7、):NaCl140;KCl2.8;TEA.Cl10;CaCl210;MgCl21;HEPES10;用NaOH校定pH为7.4;用glucose调节渗透压至314mOsm/kgH2O。每次实验的所有溶液均为新鲜配制。实验前细胞外液中补加0.5μmol/LTTX以阻断+Na通道电流。1.3电生理实验本实验采用EPC-9膜片钳放大器及其数据采集软件Pulse+PulseFit7.63(HEKA,Germany),全细胞电压钳的方式记录。去极化刺激脉冲脉宽50ms,保持电位-80mV,两次脉冲之间间隔5s。玻璃

8、电极平均入水电阻约4MΩ。+MPP来自美国RBI公司产品碘化1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-++phenylpyridiumiodine,MPPI)。由于MPP易被氧化,故配制溶液需冰浴避光操作。MPP+通过膜片钳电极向胞内注射,即形成全细胞构型后,MPP会由电极液向胞内自由扩散,若时+[7]间足够长,胞内与电极内MPP的浓度会趋于相等。本文实验中注射时间为100s左右。+无论是MPP损伤实验还是进行突起切断实验均需对细胞作两