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《苦荞胰蛋白酶抑制剂提取方法的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、山西大学学报(自然科学版)22(1):57~60,1999JournalofShanxiUniversity(Nat.Sci.Ed.)*苦荞胰蛋白酶抑制剂提取方法的研究****王转花荆艳萍毛建锋(山西大学生命科学系,太原030006)摘要分别用磷酸缓冲液、0.2mol/L硫酸、0.4mol/L三氯乙酸以及水提法从苦荞种子中提取胰蛋白酶抑制剂,对四种提取方法所得产物的抑制活性及柱层析纯化结果比较表明:以磷酸缓冲溶液为提取介质,经热变性、盐析及SephadexG-100柱层析分离后苦荞胰蛋白酶抑制剂的活性和得率较高,是较为理想的提取方法。
2、关键词胰蛋白酶抑制剂,苦荞,提取中图法分类号Q599蛋白酶抑制剂(Proteinaseinhibitor)广泛存在于动、植物和微生物中,是一类对蛋白酶有抑制作用的多肽或蛋白质,能与相应的蛋白水解酶形成一定的动态平衡,调节生物体内许多[1、2][3]重要的生命活动。蛋白酶抑制剂对胰腺炎、肺气肿等疾病有一定的疗效,已引起医药学界的普遍关注。蛋白酶抑制剂也具有抗某些病虫害的天然防御功能,能削弱或阻断昆虫[4]消化道内的蛋白酶对食物蛋白质的消化作用而使昆虫非正常发育或死亡。目前,植物抗虫基因工程研究方兴未艾,蛋白酶抑制剂是抗虫基因工程中的理
3、想元件。我国是苦荞麦生产大国,种质资源丰富,类型多种多样。苦荞中的蛋白酶抑制剂含量较高,特别是含有丰富[5]的胰蛋白酶抑制剂。研究苦荞蛋白酶抑制剂对于开发其药用价值和其抗虫转基因作物有着实际意义。本文采取几种常规实用的提取方法,分别对苦荞胰蛋白酶抑制剂进行分离纯化,并对提取效果和产物得率进行了比较,旨在寻找一条适合苦荞胰蛋白酶抑制剂的提取,且回收率和抑制活性均理想的工艺路线,为制备高纯度苦荞蛋白酶抑制剂奠定基础。1材料与方法1.1材料及试剂成熟苦荞种子(内蒙达旗苦荞)由山西省农科院提供,胰蛋白酶为华美公司产品,苯甲酰DL精氨酰对硝基苯胺(
4、BAPNA)为Sigma产品,SephadexG-100和低分子量标准蛋白质为Pharmacia产品,其余试剂均为国产分析纯。1.2方法*山西省自然科学基金资助课题**生命科学系94级学生收稿日期:1998-08-1358山西大学学报(自然科学版)22(1)19991.2.1苦荞胰蛋白酶抑制剂粗提液的制备方法:苦荞粉碎去壳,以体积比1:4加入10mmol/L磷酸缓冲液(内含0.15mol/LNaClpH7.5),室温搅拌浸提2h,3000r/min离心20min,上清液68热变性1
5、0min,迅速冷却,3000r/min离心20min去沉淀,上清液加固体(NH4)2SO4达80%饱和度,4静置过夜。10000r/min离心30min,收集沉淀,用少量0.05mol/LpH7.8磷酸缓冲液溶解,对双蒸水透析,浓缩得粗品。方法:苦荞粉碎去壳加4倍量0.20mol/LH2SO4,室温提取2h,3000r/min离心20min,上清液68热变性10min,迅速冷却,3000r/min离心20min去沉淀,上清液用4mol/LNaOH调pH至5.5,加固体(NH4)2SO4达75%饱和度,4静置过夜,以下步骤同方法。方法
6、:苦荞粉碎去壳,加10倍量0.35mol/LNaCl,室温提取2h,3000r/min离心20min,上清液加固体三氯乙酸至终浓度0.4mol/L,3000r/min离心20min去沉淀,68热变性10min,以下步骤同方法。方法:苦荞粉碎去壳,加9倍量双蒸水浸提过夜,3000r/min离心20min,去沉淀,68热变性10min,以下步骤同方法。1.2.2蛋白质含量测定:按照文献[6]方法以牛血清白蛋白为标准进行测定。1.2.3胰蛋白酶抑制剂活性测定:参考文献[7]方法略加改进,取一定量胰蛋白酶与苦荞胰蛋白酶抑制剂提取物混合,再
7、加入0.1mol/LTris-HCl缓冲液(内含0.01mol/LNaCl,pH7.8)3ml,37保温5min,加入0.5mol/LBAPNA0.01ml,放置10min后,加入33%乙酸0.5ml终止反应,410nm波长处测定光吸收值。每减少0.1个A410nmOD为一个抑制活性单位。1.2.4苦荞胰蛋白酶抑制剂的柱层析分离:苦荞提取液透析浓缩后,按文献[1]方法分批上SephadexG-100柱层析分离,洗脱液为0.02mol/L磷酸缓冲液,控制流速为0.3ml/min。[6]1.2.5纯度鉴定:采用不连续垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳,
8、分离胶浓度为12%,浓缩胶浓度为3%。2结果与讨论2.1提取物的蛋白质含量测定对上述四种提取方法得到的苦荞胰蛋白酶抑制剂粗品进行蛋白质含量测定,
