生化科技研究所微生物與細胞專題討論

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1、生化科技研究所微生物與細胞專題討論題目:DevelopingAspergillusasahostforheterologousexpression作者：DavidLubertozzi,JayD.Keasling文章來源：BiotechnologyAdvances27(1):53-75,2009演講人：Ming-YuehWu吳明玥D99B22005指導老師：Prof.Ching-TsanHuang黃慶璨教授演講日期：October4,2010演講地點：The6thClassroom摘要麴菌(Aspergillus)是一種極具潛力之異源表現宿主(heterologouse

2、xpressionhost)，包含許多經濟菌種，廣泛地被應用於許多研究中。然而，與酵母菌或細菌相較，麴菌之基因工程工具套組(toolkit)發展相當緩慢，除因其本身之複雜性外，投入之研究資源也較少。本文針對以麴菌作為表達宿主之研究歷史及現況進行回顧，並對未來可能之研究方向進行討論。Keywords：Aspergillus、Heterologous、Expression、Secondarymetabolites前言®本研究之重要性麴菌屬相當龐大，涵蓋許多知名且重要之種類。麴菌可生長於相當廣範圍之溫度、酸鹼度、水活性及滲透壓中生長(1)，並可持續外泌大量之代謝物至培養基(

3、2)，其絲狀形態使菌體可藉簡單過濾就與產物分離。因此，麴菌被廣泛應用於穀物及飲品之固態醱酵及工業酵素之生產。由於麴菌具高應用潛力，許多相關研究紛紛開始進行，如部分物種之基因體解碼(3-8)、以及超過300種基因被發現，提供研究者上百種突變株進行研究。隨著penicillin及aflatoxin生合成路徑的發現，刺激了二次代謝物之研究進展，對於麴菌對環境之影響有了更多了解。如同其他真菌，麴菌與高等生物具有高度之基因相似性，不僅有哺乳類細胞之蛋白質轉譯、摺疊及轉譯後修飾特性，也具備原核生物之簡易培養之特性，因此更適合作為重組蛋白質之表現宿主。為促進麴菌之應用性，提升特定產

4、物產量或移除其毒性，品系改良(strainimprovement)為相當重要之工作，目前多利用隨機突變及單一代謝物產量篩選之方式進行。®前人作過的研究一、麴菌轉形策略由於多細胞形態、厚質細胞壁及質體之缺乏，使得麴菌轉形策略難以發展，目前最常用之策略為原生質體轉形法、電穿孔法、基因槍法及農桿菌轉形法。由於麴菌常用於生產食用或醫用產物，故許多營養篩選標記被開發以提升其安全性。麴菌轉形過程中，基因多以非同源性插入基因體(9)，一般而言，轉形株通常帶有1~10套插入基因，且相當穩定。但非同源性插入常導致許多問題，如致死、表現量不佳或其他表現型改變等等。故許多同源性基因插入策略

5、因應而生，如以致死基因反向篩選、農桿菌轉形等。二、麴菌基因結構及系統多數麴菌基因含有內含子(intron)，其3’及5’截切點與酵母菌具高保守性，然而在酵母菌表現時卻無法被正確截切。這可能是因轉錄前及轉錄後修飾，也可能是因轉譯抑制或活化所致(10,11)。麴菌之控制元件(controlelement)多數已被定義，其CCAAT啟動子結合區與多數真核生物具有高保守性。麴菌之基因調控可主要分做廣域調控(wide-domainregulation)，如二次代謝物生產，及途徑專一性調控(pathway-specificregulation)，如產孢等。此外，麴菌具有基因群(g

6、enecluster)之構造，其在染色體上之位置對於基因調控影響甚鉅。三、麴菌異源表現為增強麴菌異源表現效能，融合輸送片段(fusioncarrier)外泌策略及蛋白酶剔除等品系改良策略均被應用。此外，不同啟動子策略亦應用於不同需求，如產量調控、表現時間調控、可誘導或回饋抑制，或與宿主代謝途徑可交互作用等。此外，3’非轉譯區及5’非轉譯區也會影響轉譯效能。麴菌之複雜基因調控使其可因應不同環境切換代謝途徑，故調控培養條件可影響其產率。而在基因層級來看，基因插入位置與宿主之高表現量基因位置愈接近，產能亦愈高。基因插入套數與表現量並無一定關係，部分多套數轉形株具有高活性，部

7、分卻會導致基因靜默(silencing)。儘管麴菌可大量表現真菌蛋白質，但非真菌蛋白質之產率仍低，可能是因轉譯效率低、mRNA前修飾不正確及mRNA穩定性差所致。前二者可能與密碼子偏好及5’非轉譯區有關，後二者則可能與融合輸送片段有關。麴菌之外泌策略相當重要，除利用菌絲多分支菌株外，亦可融合內質網指向序列(ER-targetingsequence)及提升轉醣基酶(glycosyltransferase)活性以提升外泌效力。此外，利用未折疊蛋白質效應(unfoldedproteinresponse,UPR)提升伴隨體(chaperone)及折疊酶(fo