资源描述：
《短芽孢杆菌的转化方法》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、第25卷第4期吉首大学学报(自然科学版)Vol.25No.42004年12月JournalofJishouUniversity(NaturalScienceEdition)Dec.2004文章编号:1007-2985(2004)04-0035-04短芽孢杆菌的转化方法1122彭清忠,彭清静,张惟材,朱厚础(1.吉首大学资源与环境科学学院,湖南吉首416000;2.军事医学科学院生物工程研究所,北京100071)摘要:采用Tris-PEG法、电击转化法和TSS方法对5株野生短芽孢杆菌进行了转化.其中,Tris-PEG法转化短芽孢杆菌50和735
2、,电击转化短芽孢杆菌50取得成功,转化率为102个转化子/gDNA.关键词:短芽孢杆菌;Tris-PEG法;电击转化法中图分类号:Q753文献标识码:B分泌表达作为蛋白质的一种表达形式具有以下优势:产物一般可溶、可正确折叠、有生物活性;毋需破碎细胞,工艺简单;表达产物与胞内蛋白分离,利于纯化.现有原核分泌表达系统并不尽如人意:大肠杆菌遗传背景清楚,分子克隆操作技术成熟,但在进行外源蛋白高效表达时易形成包涵体,产物分泌表达水平[1]低,且常常分泌至周质空间而不是真正的胞外;枯草杆菌具有良好的分泌性和非致病性,但胞外蛋白酶[2]活性较高,易引起产物降解.短芽孢杆
3、菌(Bacillusbrevis)不仅分泌蛋白能力强,而且胞外蛋白酶活性[3,4]低,具有分泌表达外源蛋白的天然优势.利用它们可望建立一个高效的原核分泌表达系统.[5]本课题组曾从北京周边地区筛得5株分泌蛋白能力强且没有胞外蛋白酶活性的短芽孢杆菌,并构[6]建了分泌表达载体.为了组建短芽孢杆菌分泌表达系统,建立有效的转化方法是必需的.本文尝试用Tris-PEG法、电击转化法和TSS方法对所筛5株短芽孢杆菌进行转化.其中,前2种转化方法在一些菌株中取得成功.1材料和方法1.1材料[5]菌株和质粒:短芽孢杆菌50,268,413,618和735号系本课题组从土壤筛选所得,载
4、体pBKE50系本[6]课题组构建.培养基:T2培养基和LB培养基配制详见文献[5].Tris-PEG转化用试剂:MTP溶液组成为20mL顺丁烯二酸(0.1mol/L,pH值6.5),10mL磷酸缓冲液(7%K2HPO4+2.5%KH2PO4),18mLH2O,2mLMgCl2(1mol/L),50mLT2培养基;40%PEG(聚乙二醇)溶液用20mL的顺丁烯二酸(0.1mol/L,pH值6.5)溶解40gPEG6000,加蒸馏水至100mL配制;50mmol/LTris-HCl(pH值7.5)和50mmol/LTris-HCl(pH值8.5).电击转化用试剂:电击洗脱液
5、,1mmol/LHepes(pH值7.0);电击缓冲液HG,1mmol/LHepes(pH值7.0),10%甘油.TSS转化法用试剂按文献[7]方法制备.1.2方法(1)Tris-PEG转化法:复苏短芽孢杆菌,挑取单菌落于5mL的T2液体培养基中,37振荡培养过夜;转接50L培养液至5mL的T2培养基中,37剧烈振荡培养4~5h(即菌体至对数生长期),室温4000g离心收稿日期:2004-10-15基金项目:湖南省教育厅青年基金资助项目(03B031)作者简介:彭清忠(1970-),男,湖南慈利县人,博士,吉首大学生物资源与环境科学学院副教授,主要从事微生物遗传学
6、研究.36吉首大学学报(自然科学版)第25卷5min收集菌体;用5mL的50mmol/LTris-HCl(pH值7.5)洗涤菌体沉淀,重悬于5mL50mmol/LTris-HCl(pH值8.5)溶液中,在37摇床缓慢培养30~60min;室温4000g离心5min收集菌体,用1mLMTP洗涤沉淀,离心后温和重悬在0.5mLMTP中;加入质粒DNA于悬浮细胞中混匀,迅速加入1.5mLPEG溶液,立即混匀(不要剧烈振荡),保持混合液于室温约2min,其间偶尔轻摇混匀;加入5mLMTP混匀,室温4000g离心10min收集菌体;重悬菌体沉淀于1mL含20mmol/LMgCl2
7、的T2培养基中,37温和振荡培养2.5h,其中培养30min后加红霉素(最终体积分数为0.1g/mL)以便诱导腺嘌呤甲基化酶基因的表达;涂200L转化液于T2琼脂平板(含10g/mL红霉素),于30或37培养箱培养,2~3d后观察结果.(2)电击转化法:挑取单个短芽孢杆菌菌落接种于5mLT2液体培养基中,37摇床培养过夜,取50L接种于5mLT2培养基中剧烈振荡培养至对数生长期;冰浴20min,4000g离心5~10min收集菌体;用预冷的1mmol/LHepes(pH值7.0)洗涤1次,再用电击缓冲液HG洗2
