酿酒酵母乙醛脱氢酶的克隆与表达

《酿酒酵母乙醛脱氢酶的克隆与表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、万方数据第39卷第1期2009年2月工业微生物IndustrialMicrobiologyVd．39No．1Feb．2009酿酒酵母乙醛脱氢酶的克隆与表达黄瑞1，王璐1，沈微1，张晓梅2，许赣荣¨(1．江南大学生物工程学院，江苏无锡，214122；2．江南大学医药学院，江苏元锡，214122)摘要利用PCR技术从酿酒酵母(SaccharomycescerevisiaeW303。1A)总DNA中扩增得到1．9kb乙醛脱氢酶编码基因aMh，将其连接到表达栽体pEtac，得到重组载体pEtac-aldh，重组栽体在大肠杆

2、茵JMl09中得到高效表达。对含有aMh的基因工程茵进行表达研究表明：该茵株在37℃下，以1．0mmol／LIPTG诱导5h酶活力这到22．8U，比酶活力为15．0u／nag蛋白，而对照茵株检测不到酶活力，并且该茵的耐乙醛浓度可达3．29／L。关键词：乙醛脱氢酶；酿酒酵母；克隆与表达3一羟基丙酸(3-hydrtrcypropionicacid，简称3．肿)，又名p一羟基丙酸，是一种较为活泼的化学物质，工业上可以用来合成很多重要的化工产品，还可以用于生产涂料、胶黏剂、水处理化学品和个人护理用品，在商业上具有重大的开发

3、价值⋯。目前，3．}母的生产方法主要是化学合成法，如p，溴丙酸水解法、2．氰基乙醇酸碱法、3一羟基丙醛氧化法等，这些化学合成法生产3．唧的难度较大，且产品分离纯化较复杂，生产成本较高。用微生物发酵法和化学法相比，具有成本低、操作简单、条件温和、副产物少、绿色环保等优点。目前尚未发现直接利用糖或其他有机原料产3一羟基丙酸的微生物。利用基因工程手段构建以甘油为底物发酵产3一羟基丙酸的基因工程菌涉及到两个关键酶，即甘油脱水酶和乙醛脱氢酶，首先在甘油脱水酶作用下，甘油脱水转化成3．羟基丙醛(3．卜Ⅱ)A)，然后在乙醛脱氢酶

4、的氧化作用下生成3．羟基丙酸(3一HP)，甘油脱水酶的研究已见文献报道【2叫]，而来源于酿酒酵母的乙醛脱氢酶(AIDH)克隆与表达尚未见国内文献报道，国内有文献报道草羊、华支睾吸虫乙醛脱氢酶克隆与表达【卜刮。本文主要研究酿酒酵母中乙醛脱氢酶(AIDH)克隆与表达。乙醛脱氢酶是一种复合体，含有三个亚基，分子量大小分别为54kD、49kD和12kd引，在细胞解毒和防御系统中发挥很大的作用【8qJ。乙醛脱氢酶可以将甘油代谢途径中3一羟基丙醛(3．m)A)脱氢后生成3一羟基丙酸，本研究对进一步构建利用甘油产3一羟基丙酸(3

5、．船)的基因工程菌打下了基础。1材料与方法1．1菌株和质粒大肠杆菌(Escherichiacoli)J硼09、酿酒酵母(SaccharomycescerevisiaeW303—1A)，由本实验室保藏，质粒载体pEtac【10]由江南大学沈微博士构建。酿酒酵母(SaccharomycescerevisiaeW303—1A)在现代分子和细胞生物学中用作真核模式生物，其作用相当于原核的模式生物大肠杆菌。该菌的核苷酸第303831305784个碱基为乙醛脱氢酶(aldh)基因序列，全长1954bp。1．2培养基酿酒酵母种子

6、液YPD培养基(∥L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母提取物10，pH5．5，固体培养基含209／L的琼脂。大肠杆菌LB培养基(g／L)：蛋白胨10，酵母膏5，氯化钠10，固体培养基含209／L的琼脂，固体和液体培养基在需要时加入卡那霉素至浓度50I,g／mL。发酵培养基(dL)：蛋白胨5，酵母膏5，甘油20，KH2l(P0147．5，pH5．8，乙醛经过滤除菌后加入到灭菌的培养基中。作者简介：黄瑞(1982～)，男，硕士研究生。E—mail：ruih0728@126．∞m。*通讯作者。一22—万方数据第1期黄瑞，等

7、：酿酒酵母乙醛脱氢酶的克隆与表达第39卷1．3工具酶和试剂限制性内切酶EcoRI、＆ZI，T4DNA连接酶购自TaKaRa公司；TaqDNA聚合酶、小型DNA片断回收试剂盒、以及质粒提取试剂盒购自博大泰克公司；聚丙烯酰胺、广范围蛋白质分子量标准为Promega公司产品。1．4重组大肠杆菌JMl09(pEtac．aldh)的构建酿酒酵母(SaccharomycescerevisiaeW303—1A)基因组DNA的提取，纯化质粒pEtac的提取，pEtac酶切、连接和转化见文献【l¨。根据NCBI公布的酿酒酵母z752

8、82aldh基因序列设计合成PCR引物。上游：5’ACCGG—AA—TTCATGTTCAGTAGA-TCTACGC一3’下游：5’一AC(Ⅺ垡匹IG垒gn?AC脚CCAA·T1vrI观．3’引物两端分别引入E幻RI酶切位点和SalI酶切位点，下划线处为引入酶切位点。以酿酒酵母基因组DNA为模板完成PCR反应。PCR反应条件为：PCR总反应体系为50止：dNT