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《三角褐指藻-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及在酿酒酵母中的表达.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、三角褐指藻D5-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及在酿酒酵母中的表达杨哲,魏东盛,邢来君,李明春南开大学微生物学系分子微生物学与技术教育部重点实验室,天津300071摘要:D5-脂肪酸脱氢酶是合成花生四烯酸的关键酶。根据已报道的D5-脂肪酸脱氢酶基因设计引物,分别从三角褐指藻基因组DNA和总cDNA中扩增得到1520bp和1410bp的特异片段,序列分析结果显示,结构基因中含有一个大小为110bp的内含子,这是国内外首次报道。将D5-脂肪酸脱氢酶基因亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES2.0中,在大肠杆菌中筛选到含有目的片段的重组质粒p
2、YPTD5,用电击转化的方法将重组质粒pYPTD5转化到营养缺陷型酿酒酵母菌株INVSc1中,在缺省培养基中筛选得到酿酒酵母转化菌株YPTD5。在合适的培养条件下,添加外源底物双高g-亚麻酸和诱导物半乳糖,培养并收集菌体。通过脂肪酸甲酯气相色谱分析,表明三角褐指藻D5-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中获得了高效的表达,将双高g-亚麻酸转化为花生四烯酸,其底物转化率达到了45.9%。关键词:花生四烯酸,酿酒酵母,功能验证CloningandexpressioninSaccharomycescerevisiaeofD5-fattyaciddesa
3、turasegenefromPhaeodactylumtricornutumZheYang,DongshengWei,LaijunXing,andMingchunLiKeyLaboratoryofMolecularMicrobiologyandTechnology,MinistryofEducation,DepartmentofMicrobiology,NankaiUniversity,Tianjin300071,ChinaAbstract:Δ5-fattyaciddesaturaseisthekeyenzymeinsynthesisof
4、arachidonicacid.TwospecificfragmentwasclonedfromgenomicDNAandtotalcDNAofPhaeodactylumtricornutumthroughPCRwithprimerdesignedaccordingtothereportedsequences,respectively1520bpand1410bp.ComparisonofthegenomicandcDNAsequencesrevealedthattheΔ5-fattyAcidDesaturasegenefromgenom
5、icDNAhadan110bpintron.The1.4kbwassubclonedintotheyeast-E.colishuttlevectorpYES2.0,thenanexpressionrecombinantplasmidpYPTD5contatiningtargetgenewasconstructed.TheplasmidpYPTD5wastransformedintodefectivemutantINCSc1ofSaccharomycescerevisiaeforexpressionbyelectrotransformati
6、onmethod.Dihomo-g-linolenicacidwasprovidedasanexogenoussubstratetotheyeastcultures,withgalactoseasinducer.ByGCdetecting,therecombinantS.cerecisiaehadarachidonicacid.TheresultsindicatedthathighlevelexpressionofΔ5-fattyaciddesaturase,andthesubstrateconversionreached45.9%.Ke
7、ywords:arachidonicacid,Saccharomycescerevisiae,functionalidentification多不饱和脂肪酸(Polyunsaturatedfattyacids,PUFAs)是指含有2个或2个以上双键,碳原子数在16~22的直链脂肪酸[1]。多不饱和脂肪酸的代谢从油酸(Oleicacid,OA)开始,在Δ12-脂肪酸脱氢酶的催化下形成亚油酸(Linoleicacid,LA),亚油酸可以在Δ15-脂肪酸脱氢酶催化下形成a-亚麻酸(α-linolenicacid,ALA),从而进入多不饱和脂肪酸
8、代谢的n-3途径,也可以直接进入n-6途径,经过一系列延长酶和脱氢酶的催化,可以转化成一系列长链多不饱和脂肪酸(Long-chainpolyunsaturatedfattyacids,LC-P
