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《油菜叶绿体基因组同源重组片段的克隆及phb基因定点整合载体的构建_张中林》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、植物生理学报,ActaPhytophysiologicaSinica2001,27(3):235～242235油菜叶绿体基因组同源重组片段的克隆及phb基因定点整合载体的构建1＊2＊＊1121张中林张景昱李轶女苏宁宋艳茹沈桂芳(1中国农业科学院生物技术研究所,北京100081;2中国科学院植物研究所,北京100093)摘要:利用叶绿体基因组在进化过程中高度保守的特3-酮硫裂解酶基因phbA(叶梁等1999)、乙酰乙酰点,根据烟草、水稻和玉米叶绿体基因组全序列资料,CoA还原酶基因phbB和PHB合酶基因phbC(谢安设计合成引物,PCR
2、扩增并克隆了油菜叶绿体两个重勇等1995),构建了含有质体转运肽的组成型表达要的功能基因rbcL和atpB(GenBank登录号分别为载体和种子特异性表达载体,并分别在烟草和油菜AF267640和AF267641),并以此作为定点整合外源基中获得了转录水平的表达(叶梁等2000)。产物检因的同源重组片段。以来自叶绿体的强启动子PpsbA测工作正在进行之中。和Prrn等驱动PHB合成途径中3个关键酶基因phbA、最近,又有多个研究小组尝试以不同的方式,phbB和phbC,分别构建表达盒,并将它们按照其在原利用植物来表达PHA。包括将基因产
3、物定位到乙始菌株中的自然转录顺序phbC-phbA-phbB相串联,最后连同选择标记基因aadA表达盒一起,克隆到油菜酰CoA丰富的白色体(Houmiel等1999)、过氧化物叶绿体同源片段中,构建成phb基因定点整合载体酶体(Mittendorf等1998,Hahn等1999)和乙醛酸循pRCABZ和pRCABF。酶切及Southern杂交结果证明所环体中(Mittendorf等1998)。虽然上述研究都获得构建的转化载体符合预期设计。叶绿体转化及后续工了一定量的PHA表达,但总体来说表达量仍不高。作目前正在进行之中。在底物供应不足的
4、矛盾得到解决之后,限制PHA在转基因植物中进一步积累的另一个瓶颈因关键词:phb基因,叶绿体转化,同源片段,定点整合,素很可能是,来自原核的外源目的基因与真核表达油菜体系之间不能很好地相互兼容。因此尝试将phb学科分类号:Q78基因本身而不是其表达产物直接定位到叶绿体基因组中,利用叶绿体基因组转录与翻译系统的原核聚-3-羟基链烷酸酯(polyhydroxyalkanoate,特性来解决基因相容性问题。本文在这一设想的PHA)是自然界中存在的一类贮藏性微生物聚酯,基础上,进行了油菜叶绿体基因组同源重组片段的广泛存在于多种微生物中,是许多细
5、菌等的碳源和克隆和phb基因定点整合载体的构建。以期为进能量贮存物质(Madison和Huisman1999)。由于其一步研究phb基因在油菜叶绿体中的表达奠定基完全的生物可降解性以及良好的物理机械特性和础。生物相容性,PHA被认为是石油化工塑料最具竞争力的替代品。通过细菌发酵法现已实现PHA的1材料与方法小规模商业化生产,然而由于高昂的发酵底物和复1.1植物材料杂的发酵工艺,产品成本居高不下,在市场上无法甘蓝型油菜(Brassicanapuscv.H165)冬性品与化工塑料相竞争。种。种子种植于无土基质(蛭石+营养液)中,并放1992
6、年,美国科学家率先将PHB(polyhydroxy-置在恒温光照培养箱内,于26℃、光周期16h/8h、butyrate)合成途径从细菌体内移植到高等植物中-2-1光强约36μmolms条件下培养。约45d后,切(Poirier等1992),试图以此来降低PHB的生产成本。但由于在植物体内,PHB合成与植物内源代谢取幼苗叶片参照张中林等(1999)的方法提取叶绿途径相互竞争底物乙酰CoA,致使转基因植株生长体DNA。严重受阻。后来他们又通过质体转运肽介导的方1.2质粒及各种分子生物学试剂式,将PHB合成途径中关键酶基因的产物定位到各种限
7、制性内切酶和VentDNA聚合酶等均购含有丰富乙酰CoA的质体中,从而解除了植物生自Biolabs公司;T4DNA连接酶、绿豆核酸酶、T4长受抑制的现象,也使PHB产量有了显著提高(Nawrath等1994)。2000-07-21收到,2001-01-02接受。＊通讯联系人,E-mail:zhangzhonglin@263.net。近年来,我们从罗氏产碱杆菌(Ralstoniaeu-＊＊并列第一作者。tropha)中克隆了PHB合成所需的3个关键酶基因:236植物生理学报27卷DNA聚合酶、碱性磷酸酶(CIAP)和dNTPs等购自源的D
8、NA片段。其作用是通过与叶绿体基因组的Promega公司;DNA回收试剂盒NucleoTrap为Clon-相应区段发生同源重组,以双交换的方式将这两段Tech公司产品;TaqplusⅠDNA聚合酶为上海生工
