蛋白质化学中的层析技术

《蛋白质化学中的层析技术》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第四章蛋白质化学中的层析技术层析法也称色谱法(chromatography)，是1906年俄国植物学家MichaelTswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”。1941年，英国生物学家Martin和Synge首先提出了色谱塔板理论，为后来各种色谱技术的发展奠定了基础。第一节层析概述第二节离子交换层析第三节亲和层析第四节凝胶过滤第五节疏水层析第六节分配层析第七节吸附层析第一节层析概述一、层析的原理层析技术是

2、一组相关分离方法的总称，当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随流动相向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配，从而达到将各组份分离的目的。二、层析的分类按固定相基质的形式：柱层析、纸层析和薄层层析根据流动相的形式：液相层析、气相层析凝胶过滤原理吸附层析疏水层析分配层析亲和层析离子交换三、层析前蛋白质处理主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白

3、分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。1、盐析法盐离子与水分子作用，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的水化层，暴露出来的蛋白质表面疏水性区域相互结合，形成沉淀。2、等电点沉淀在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入盐离子会破坏这些吸引力，使分子散开，溶入水中。3、有机溶剂沉淀降低水溶液的介电常数，增加蛋白质不同电荷之间的静电引力，使蛋白质产

4、生沉淀；有机溶剂与水作用使蛋白质的表面水化层厚度压缩，导致蛋白质脱水，蛋白质间的疏水作用增强，从而产生沉淀。四、层析基本操作过程装置选择上样和洗脱结果检测上样均一性洗脱装置目的不同检测方法不同活性检测基质均匀性柱层析的L/d比值1、柱层析的L/d比值2、洗脱装置不改变溶剂体系依靠液面的水位差产生的静压力致使洗脱液不断流经层析柱缺点：随着溶液的流去，水位差也逐渐减小，流速也在变小。改善：蠕动泵或恒流泵维持流速恒定的简易装置改变溶剂系统分级洗脱在一个溶剂系统洗涤后，改用另一溶剂系统。缺点：蛋白质和层析基

5、质的结合强度相差并不很大，溶剂系统的改变又不可能过细过密同一个洗脱级分中就可能含有两种或两种以上的蛋白质，达不到分离纯化的目的。递减递增pH阴离子交换树脂阳离子交换树脂离子强度疏水层析离子交换层析改变溶剂系统梯度洗脱一种溶液以恒定的速度连续地进入处于温和搅拌的盛有另一种溶液的容器中，经混合后的液体以同速度沉入层析柱作为洗脱液，在这样所得到的洗脱液中一种溶液的浓度以线性梯度方式连续地发生改变。注意：梯度洗脱呈现一个峰，但有可能存在两个性质接近的蛋白质。线性梯度洗脱装置性能未知样品的蛋白质分离：改变缓慢

6、的梯度洗脱→若为单峰：分级洗脱3、结果检测活性检测比活没有提高目的蛋白与杂蛋白并没有分开比活有所提高，但总活性回收很低目的蛋白有损失或有失活现象测定蛋白质一级结构时，可不考虑目的蛋白的生物活性结果保存薄层层析&纸层析照相保存or扫描仪转为图形or积分仪变成数据柱层析检测器、记录仪和积分仪处理4、层析装置的仪器化HPLC与微机、质谱等连用第二节离子交换层析一、原理离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术

7、。原理：利用物质的电荷和层析载体的电荷间的相互作用，进而达到分离纯化的目的。高分子聚合物基质、配基和平衡离子↙共价结合平衡离子平衡离子是结合于配基上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。阳离子交换剂：平衡离子带正电的离子交换剂，能与带正电的离子基团发生交换作用阴离子交换剂：平衡离子带负电的离子交换剂，与带负电的离子基团发生交换作用pH值的影响NH3RCOOH+NH3RCOO+-RNH2COO-LowpHPositivechargeHighpHNegativechargeHydro

8、gengainedHydrogenlost离子溶度影响→离子浓度增加+离子取代顺序离子交换剂的基质琼脂糖离子交换剂离子交换交联葡聚糖聚苯乙烯离子交换纤维素1、离子交换纤维素交换剂名称（纤维素）作用基团特点阴离子交换剂二乙氨基乙基DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H最常用在pH8.6以下三乙氨基乙基DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H氨乙基AE+-O-C2H4-NH2胍乙基强碱性、极高pH仍有效阳离子交换剂羧甲基CM—-O-CH2-COO—最常用在pH4