蛋白质的离子交换层析技术

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1、离子交换层析技术层析（chromatography）也称为色谱，就是将混合物中各种组分分离的方法，是分离、纯化及鉴定生物大分子时最常使用的技术之一。一个层析系统都包括两相，即固定相和移动相。当移动相流过加有样品的定相时，由于各组分在两相之间的分配比例不同，它们（各组分）就会以不同的速度移动而相互分离开来。定相可以是固体，也可以是被固体或凝胶所支持的液体。定相可以被装入柱中或涂成薄层、薄膜，成为层析“床”。动相可以是气体，也可以是液体，前者称为气相层析，或者成为液相层析。离子交换层析技术是以离子交换纤维素、离子交换树脂或离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以待分离的样品为移动相，分离和提纯

2、蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。（一）原理在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳离子基团时，可换出阴离子，则称为阴离子交换剂。如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）纤维素。在纤维素上结合了DEAE，含有带正电荷的阳离子纤维素—O—C6H14N+H，它的反离子为阴离子（如Cl-等），可与带负电荷的蛋白质阴离子进行交换。当结合阴离子基团时，可置换阳离子，称为阳离子交换剂，如羧甲基（Carboxymethy，CM）纤维素。纤维素分子上带有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2－COO一），其反离子为阳离子（如Na+等）,可与带正电荷蛋白质阳离子

3、进行交换。   溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷。反之，溶液的pH值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。溶液的pH值距蛋白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。反之则越少。血清蛋白质均带负电荷，但各种蛋白质带负电荷的程度有所差异，以白蛋白为最多，依次为α球蛋白，β球蛋白和γ球蛋白。   在适当的盐浓度下，溶液的pH值高于等电点时，蛋白质被阴离子交换剂所吸附；当溶液的pH值低于等电点时，蛋白质被阳离子交换剂所吸附。由于各种蛋白质所带的电荷不同。它们与交换剂的结合程度也不同，只要溶液pH值发生改变，就会直接

4、影响到蛋白质与交换剂的吸附，从而可能把不同的蛋白质逐个分离开来。   交换剂对胶体离子（如蛋白质）和无机盐离子（如NaCl）都具有交换吸附的能力，当两者同时存在于一个层析过程中，则产生竞争性的交换吸附。当Cl-的浓度大时，蛋白质不容易被吸附，吸附后也易于被洗脱，当Cl-浓度小时，蛋白质易被吸附，吸附后也不容易被洗脱。因此，在离子交换层析中，一般采用两种方法达到分离蛋白质的目的。一种是增加洗脱液的离子强度，一种是改变洗脱液的pH值。pH值增高时，抑制蛋白质阳离子化，随之对阳离子交换剂的吸附力减弱。pH值降低时，抑制蛋白质阴离子化，随之降低了蛋白质对阴离子交换剂的吸附。当使用阴离子交

5、换剂时，增加盐离子，则降低pH值。当使用阳离子交换剂时，增加盐离子浓度，则升高溶液pH值。7  （二）常用离子交换剂的种类与特性   1.离子交换纤维素 离子交换纤维素的种类很多，其种类与特性如表1－1所示。表1-1离子交换剂的类型与特点交换剂名  称（纤维素）作用基团特     点阴离子交换剂二乙氨基乙基DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H最常用在pH8.6以下三乙氨基乙基DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H 氨乙基AE+-O-C2H4-NH2 胍乙基强碱性、极高pH仍有效 阳离子交换剂羧甲基CM—-O-CH2-COO—最常用在pH4以上磷酸P－-O-PO2－用

6、于低pH 磺甲基SM－-O-CH2-SO3－ 磺乙基SE－-O-C2H4-SO3－强酸性用于极低pH在交换纤维素中，最常用的是DEAE纤维素和CM纤维素。由于剂型不同，其理化性质和作用也有所差异。一般而言，微粒型要优于纤维素型，因为微粒型是在纤维素型的基础上进一步提炼而成。它的交换容量大，粒细、比重大，能装成紧密的层析柱，要求分辨力高的实验可用此型纤维素（见表1－2）。表1-2商品DEAE—纤维素和CM纤维素的类型和特性纤维素形状长度交换当量（毫克当量/克）蛋白质吸附容量（mg/g牛血清白蛋白）床体积（ml/g）pH6.0pH7.6DE-22改良纤维12~400  1.0±0.1

7、4507.77.7DE-23改良纤维（除细粒）18~400 4508.39.1DE-32微粒型（干）24~636606.06.7DE-52微粒型（湿）24~636606.06.3DE-11旧型号50~250130     与以上相应型号同 溶菌酶pH5  CM-220.6±0.066007.77.7CM-23 6009.19.1CM-32 12606.86.7CM-521.0±0.112606.86.77离子交换纤维素的优点为：①离子交换纤维素为开放性长链，具有较大的表面积，吸附