(信息与通信)蛋白质层析技术

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1、蛋白质层析技术蛋白质层析介质蛋白质层析技术蛋白分离纯化平台及单抗的分离纯化蛋白质层析的原理和要点层析的概念流动相固定相C流出组份123123洗脱峰层析一般地是一种物理方法层析的热力学分析：分配;吸附等温线；吸附---脱附（解吸附，洗脱）；线性和非线性过程层析的动力学分析：塔板理论（板高方程）层析是最强有力的分离手段液相层析生化分离技术，基因工程技术和免疫学技术并称为生物技术（Biotechnology）液相层析是生物大分子分离纯化的最重要手段蛋白液相层析的应用已知和未知蛋白质的纯化结构、动力学、药物作用靶点研究对高纯蛋白的需要免疫学研究及酶免检

2、测抗体抗原的制备基因工程药物生产基因治疗对大量质粒的需要蛋白液相层析的构成分析型层析柱和制备型层析柱分析层析：上样量在吸附等温线的前至中段的线性范围中，可以快速定量分析样品，建立纯化方法制备层析：上样量在吸附等温线的中至后段的非线性范围中，不同组分间的相互作用不可忽略，大量纯化样品获得蛋白产物层析仪蛋白分析和纯化实现的设备蛋白液相层析的一般程序样品处理选择分离机制建立初步纯化流程流程优化放大Polishing(精细纯化)样品制备一般性处理去处颗粒物——5µm、2µm、0.45µm分级过滤，0.2µm除菌蛋白样品的富集和浓缩脱气纯化过程中样品处理脱盐和缓冲液

3、交换去污剂的去除离子污染物的去除其它的处理和浓缩分离纯化机制ChargedGroups(asp,glu,lys,arg,his)IonExchangeandChromatofocusingHydroxyapatiteElectrostaticCoordinationcomplexes-Repulsion-Geometricchargedistribution-SizeandShapeGelFiltrationBindingSiteBiospecificAffinityChromatographyHydrophobicRegion(phe,trp,ile,l

4、eu,val,gly,ala,tyr)HydrophobicInteractionChromatography(HIC)ThiolGroups(cys)CovalentChromatography蛋白质层析介质基体须具备的特性生物兼容性：亲水性，大孔径.不会使生物大分子失活，没有生物化学毒性：过强吸附，泄漏，氧化还原性化学稳定性：在生物大分子存在的化学条件下是稳定的.pH,络合物,巯基化合物…必要的机械性能:流体中的耐压性结构:典型层析介质的放大观察下图:2%agarosegel白线段:500nm右图:SephacrylS-500右上:白线段10um右下

5、:白线段0.5um化学组成:亲水多孔高聚物等天然高分子多糖:纤维素,交联葡聚糖,琼脂糖及共聚物----孔径分布宽,较软合成高聚物:聚丙烯酰氨类,聚丙烯酸脂类,聚乙二醇聚丙烯酸脂共聚物,亲水性处理的聚苯烯类无机化合物:硅胶,羟基磷灰石,氧化锆聚合物基体(matrix)孔的结构孔径分布:分配层析要求分布宽,均匀,相应于低交联度高交联度导致孔径分布偏向高,介质本身微观不均匀性变大,适合大孔径高硬度吸附层析孔的结构可分为三种类型标志产品:SepharoseHP，Toyopearl；MacroPrep，UNOSphere，SOURCE；UNOQ，POROS基体孔结构

6、决定传质特点孔结构决定扩散速率：孔的开放性越大，扩散越快，对层析的流速越不敏感；反之亦反动态载量（DynamicCapacity）动态载量是制备层析的重要概念：层析过程是偏离平衡态的，流速越大，偏离越远，反之亦反动态载量是制备层析介质的重要性能指标，更快更高是人类活动的重要目标层析介质颗粒度与动态载量小颗粒传质更迅速，动态载量更高IgG1在不同颗粒度的Bio-Rad陶瓷性羟基磷灰石上的动态载量比较Buffer-0.05MMES,pH6.5;Flowrate:600cm/hr吸附动力学与动态载量长程作用（库仑力）比短程作用（疏水相互作用）受流速影响小些；粘度

7、与动态栽量负相关从动态载量看上样条件BSA在阴离子交换介质上的动态载量：吸附量对洗脱剂的非线性：动态载量对洗脱剂强度远比对其洗脱体积敏感吸附蛋白的大小与动态载量层析介质表面吸附功能基团的密度大大超过实际用来吸附蛋白的量小分子对层析介质表面吸附功能基团的密度更加敏感柱效依赖于层析介质对样品的选择性和分离带宽.在多孔颗粒介质的柱子中带宽或柱效表示为：H=2d+B/V+Cmd2V+Csd2Vd=层析介质离子直径=填充不规则因子H=Plateheight塔板高度或柱效A=Eddydiffusion涡流扩散B=Longitudinalmoleculardiffu

8、sion径向扩散(可忽略)Cm=non-equilibriumma