蛋白印迹成功指南

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1、蛋白印迹成功指南源自CellSignalingTeChnology

2、www.cellsignal.comWB蛋白印迹技术是阐释生物过程和疾病背后复杂信号事件的强有力工具。本文重点阐述了蛋白印迹操作流程中的关键步骤，并展示了操作流程变化对您最终印迹结果的影响。简介蛋白印迹也称作免疫印迹，是一种被广泛应用并得到公认的技术，用于检测细胞或组织提取物中的蛋白表达水平。这一技术利用抗体与特定待检测蛋白的结合，测定生物样本中的蛋白水平。抗体与其靶点蛋白表位的精确结合可用于检测蛋白质中具有高度特异性的氨基酸序列。抗体也可检测

3、蛋白质的特异性翻译后修饰（PTM）。磷酸化特异性抗体已用于确定特定信号通路组分以及研究在不同生物学背景下磷酸化事件的变化。最近研发出了针对其他PTM的特异性抗体。这使得研究人员可以监控蛋白质乙酰化、甲基化或泛素化状态的变化。CellSignalingTechnology（CST）的科学家每天进行一千多次免疫印迹实验以验证我们现有和新的抗体。过去十多年我们一直对免疫印迹操作流程进行优化，您可以参阅第13页，也可以在线阅读（见下面链接）。这样您可以重复这一过程并得到可重复且可靠的结果。在此，我们将重点讲述蛋白印迹操

4、作流程中的关键步骤，并展示操作流程变化对您最终印迹结果的影响。我们还将讨论在您的免疫印迹试验中使用经严格验证抗体的重要性。最后，我们将提供CST科学家常用且最适用于与抗体配套使用的试剂清单。蛋白印迹技术是了解生物过程和疾病背后复杂信号事件的强有力工具。www.cellsignal.com/WBProtocol2110步实现更好的++++homogenoustissueorcellsWB实验结果solution在此，本文概述了我们所推荐的操作步骤，并讨论成功实验的关键步骤。根据我们在免疫样品制备印迹方面的丰富经验

5、，作为我们验证、批次测试和技术支持流程的一部分，我们将给出试裂解缓冲液和超声处理=剂和实验过程的建议。尽管免疫印迹技术被广泛应用和认可，但是仍会出现问题导致出现更好的释放出蛋白次优结果，这可能会耗费时间且令人沮丧。本文旨在通过提供建议，帮助您在最短的时间、以最少的终端用户优化调整得到预期结果，提升免疫印迹效果。2345SDS-PAGE湿转移封闭一抗孵育在适当的条件下电泳至硝酸纤维素膜在含5%牛奶的TBST中在4℃、含5%BSA或脱脂牛奶*的TBST中孵育过夜*见产品说明书建议9876检测洗涤二抗孵育洗涤在用于化

6、学发光检测之前，在TBST中3x5分钟室温下1小时于含5%在TBST中3x5分钟立即混合试剂脱脂牛奶的TBST中Phospho-10p44/42MAPKkDa(Thr202/Tyr204)p44/42/MAPKOverlay1758058成像46化学发光成像具有更大的灵活性并且www.cellsignal.com/WBProtocol30操作简单177–+––+––+–U0126––+––+––+TPA3经严格验证抗体的重要性一抗是影响数据质量的关键试剂。质量较差的一抗可对实验结果造成干扰，导致结果无法解释或存

7、在误解。要确保抗体对待检测靶标具有特异性，则应验证抗体特异性。验证抗体特异性时，只在预期分子量位置观察到条带是不够的。抗体应经历严格的验证过程，采用若干不同的方法确保抗体能准确检测靶标。抗体验证包括：•在已报道证实蛋白表达的细胞和组织提取物中进行特异性检测，而不仅仅是在重组蛋白中。•通过使用siRNA转染或敲除细胞系进行特异性确认。•用诱导或抑制靶标蛋白表达的生长因子、化学活化剂、或抑制剂处理细胞系，直接进行翻译后修饰的抗体特异性检测。•通过磷酸酶处理，对磷酸化抗体进行磷酸化特异性检测。www.cellsign

8、al.com/WBValidation4掌控您的WB检测在任何实验中，我们都应考虑包含适当的对照。阳性和阴性对照可使您进一步确定抗体检测到特异性信号。下图中，采用阴性（U0126处理）和阳性（TPA处理）Jurkat裂解产物，以及纯化重组的酪氨酸磷酸化蛋白，评估 Phospho-p44/42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)抗体。使用经严格验证抗体和纳入适当实验对照的重要性体现在：其他供应商抗体在阴性对照裂解产物中以及与非靶标磷酸化-酪氨酸蛋白的交叉反应情况。上样对照用于确保凝胶上样量相等，

9、以及样本的完整性，且在对免疫印迹结果进行定量比对时也很重要。当使用修饰位点特异性抗体评估蛋白活化位点变化时，应使用相应的总蛋白抗体，以确保相同的上样量和样本完整性。在许多细胞系和组织中持续表达的蛋白，如β-actin、α-tubulin和GAPDH，在旨在比较多个样本的总蛋白水平的实验中通常被用作上样对照。当您制备细胞核和细胞质提取物时，应使用细胞分离标志物，用于确认裂解产物制备适当。