《蛋白质印迹》PPT课件

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1、Westernblot实验技术概论印迹法是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法(southernblot)。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析。Northernblot:对RNA的印迹分析Westernblot:对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析Easternblot:对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析概论Westernblot：把电泳分离

2、的蛋白质转移到固定膜上，并用抗原抗体反应进行特异性检测的过程。是集电泳、转印和免疫标记为一体的蛋白质分离检测技术,结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）的靶蛋白。Westernblot是检测蛋白质混合溶液中目的蛋白的定性方法，也可作为确定目的蛋白在不同细胞或同种细胞在不同条件下的相对含量的半定量方法Westernblot测定的不是蛋白的绝对含量，只是目的蛋白的相对含量：目的蛋白的存在与否特定实验条件下目的蛋白表达量的变化多种因素影响信号的强弱受，一般仅作为半定量指标不同

3、目的蛋白由于所用检测的抗体不同，其含量不具有可比性WesternBlot一般流程蛋白样品的制备SDS-PAGE电泳转膜鉴定膜上特定蛋白封闭一抗杂交二抗杂交底物显色WesternblottingIsolationIdentification1.蛋白样品提取：总体原则1）提取时尽可能只集中于提取目的蛋白。通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品2）保持蛋白的处于溶解状态通过裂解液的PH盐浓度表面活性剂、还原剂等的选择3）提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂4）尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子

4、通过加入核酸酶或采取不同提取策略5）样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。一、蛋白质的样品制备通过稀释使不同样品具有相同浓度，必要时需要对蛋白进行浓缩。常用的蛋白浓度测定方法包括：Bradford法，Lowry法，BCA法2.蛋白质浓度测定方法原理灵敏性干扰因素应用Lowry法Folin－酚试剂法蛋白质在碱性溶液中肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，还原酚磷钼酸产生蓝色化合物，蓝色深浅与蛋白质浓度呈线性关系较高（约5μg/ml）适用于脂类含量较高的样品测定，也能耐受相当浓度的去垢剂如SDS。受硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸

5、；各种硫醇干扰耗费时间长40～60分钟；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化;标准曲线不是严格的直线形式，专一性较差Bradford法考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合呈蓝色，在波长595nm吸收峰，在一定的范围内与蛋白质的含量呈线性关系高（约1～5μg/ml）,易受强碱性缓冲液，TritonX-100，SDS等去污剂的影响快速5～15分钟，颜色稳定；深浅随不同蛋白质变化;标准曲线有轻微的非线性BCA法BCA法基于双缩脲原理，碱性条件下蛋白质将Cu2+还原成Cu+，BCA螯合Cu1+作为显色剂，产生兰紫色并在562nm有吸收峰很高（0

6、.5-20μg/ml）不易受一般浓度去污剂的干扰可受螯合剂、略高浓度的还原剂的影响较快40分钟内，抗干扰能力强SDS-PAGE电泳，是在PAGE系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的空间结构，而电泳系统中存在的强还原剂（DTT或β-巯基乙醇）能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的棒状结构的SDS-蛋白质复合物，降低或消除了不同蛋白质分子间天然的电荷和分子形状的差异，蛋白质在电泳时的迁移速度仅取决于其分子大小。二.SDS-PAGE电泳

7、当SDS单体浓度>1mm时，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/g蛋白质)，形成蛋白质SDS复合物当分子量在15～200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX式中：MW:分子量X:迁移率k、b:常数电泳迁移率与分子量的对数呈线性关SDS－PAGE电泳消除了原携带电荷的差别，迁移仅与分子量有关除了电荷作用，同时具有分子筛作用丙烯酰胺(Arc)和N,N’-亚甲双丙烯酰胺(Bis)SDS配胶的Tris缓冲液TEMEDAP(时间)Tris-甘氨酸电泳缓冲液凝胶成份以温热(利于溶解)的去离

8、子水配制含有29%(w/v)Arc和1%(w/v)Bis储存液,储于棕色瓶，4℃避光保存。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太