蛋白质印迹分析

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1、实验四蛋白质印迹分析【实验目的】了解蛋片质卬迹法的基木原理及其操作和应用。【实验原理】蛋白质卬迹法又称为免疫卬迹法，这是一种nJ以检测固定在固相载体上蛋白质的免疫化学技术方法。待测蛋白既口J以是粗提物也可以经过一定的分离和纯化,另外这项技术的应川需要利用待测蛋口的单克隆或多克隆抗体进行识别。如图所示，可溶性抗原，也就是待测蛋口首先要根据其性质，如分子量，分子大小，电荷以及其等电点等采用不同的电泳方法进行分离;通过电流将凝胶中的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上；利用抗体(一抗)与抗原发生特异性结合的原理，以抗体作为探针钓

2、取目的蛋白。值得注意的是在加入一抗前应首先加入非特界性蛋白，如牛血清白蛋白对膜进行“封卩FL”而防止抗休与膜的非特异性结合。经电泳分离示的蛋白往往需再利用电泳方法将蛋白质转移到固相载体上,我们把这个过程称为电泳印迹。常用的两种电转移方法分别为：1.半干法：凝胶和固相载体被夹在用缓冲溶液浸湿的滤纸之间，通电时间为10分钟〜30分钟。2.湿法：凝胶和固相载体夹心浸放在转移缓冲溶液中，转移时间对从45分钟延长到过夜进行。由于湿法的使用弹性更大并且没有明显浪费更多的时间和原料，因此我们在这里只描述湿法的基本操作过程。对于冃

3、的蛋白的识别需要采用能够识别一抗的笫二抗体。该抗体往往是购买的成品，已经被结合或标记了特定的试剂，如辣根过氧化物酶。这种标记是利丿IJ辣根过氧化物酶所催化的一个比色反应，该反M的产物有特定的颜色且固定在固相载体上，容易鉴别。因此可通过对二抗的识别而识别一抗，进而判断出忖标蛋白所在的位置。其他的识别系统包括碱性磷酸酶系统和図1标记系统。【实验材料】1.实验器材SDS/PAGE实验相关材料；电转移装置；供电设备；PVDF膜(M订liporelmmobion-P#1PVH00010)；Whatman3MM纸；其他工具：蹑

4、了、海绵集、的子、手套、小塑料或玻璃容器、浅盘。2.实验试剂(1)10x转移缓冲溶液(IL)：3O.3gTrizmabase(0.25M),144g甘氨酸(1.92M),加蒸馅水至］L,此时pH约为&3,不必调整。(2)lx转移缓冲溶液(2L)：在1.4L蒸馆水中加入400ml甲醇及200milOx转移缓冲溶液。(3)TBS缓冲溶液:将1.22gTris(10mM)8.78gNaCl(150mM)加入到1L蒸馆水中,用HC1调节pH至7.5。(4)TTBSbuffer：在1LTBS缓冲溶液中加入0.5mlTween

5、2()(0.05%)。(5)一抗：兔抗待测蛋口抗体(多克隆抗体)。(1)二抗：辣根过氧化物酶标记羊抗兔。(2)3%封阻缓冲溶液(0.5L)：牛血清白蛋白15mg加入TBS缓冲溶液并定容至0.5L,过滤，在£C保存以防止细菌污染。(3)0.5%封阻缓冲溶液(0.5L)：牛血清白蛋白2.5mg加入TTBS缓冲溶液并定容至0.5L,过滤，在4七保存以防止细菌污染。(4)显影试剂：1ml氯蔡溶液(30mg/ml甲醇配置)，加入10ml甲醇，加入TBS缓冲溶液至5()ml,加入30ul30%H2O2o(5)染色液：lg氨基黑

6、18B(0.1%),250ml异丙醇(25%)及100ml乙酸(10%)用蒸绸水定容至ILo(6)脱色液：将350ml异丙醉(35%)和20ml乙酸(2%)用蒸憎水定容至1L。蛋白质印迹法基木操作过程【实验操作】1・・蛋白质的分离根据冃的蛋白的性质，利用电泳方法将其进行分离。为捉高电转移的效率，通常采用SDS/PAGE技术。分离实验结束后，首先将样站墙的上边缘用小刀去除，然后在胶板的右上角切一个小口以便定位，小心放入转移缓冲溶液中待用。2••电转移(1)准备PVDF膜根据胶的大小剪出一片PVDF膜，膜的人小应略微小

7、于胶的人小。将膜置于甲醇屮浸泡1分钟，再移至转移缓冲溶液屮待用。（〉（）（）（）（〉（）（）（）i黑色筛孔板海绵垫3MM纸PVDF膜门丨门1!1!门！1丨I11丨门！1I门1【HTD凝胶3MM纸（23们G£2£23G们GG们G33】白色筛孔板夹心放置顺序（2）制作胶膜夹心在一浅盘屮打开转移盒,将一个预先用转移缓冲溶液浸泡过的海绵垫放在转移盒的黑色筛孔板上，在海绵垫的上方放置经转移缓冲溶液浸湿的3MM纸，小心地将胶板放在3MM纸上，并注意排除气泡。将PVDF膜放在胶的上方同吋注意排除气泡，再在膜的上方放上一张同样用转

8、移缓冲溶液浸湿过的3MM纸并赶出气泡，放置另一张浸泡过的海绵集，关闭转移盒。将转移盒按照正确的方向放入转移槽屮，转移盒的黑色筛孔板贴近转移槽的黑色端,转移盒的口色筛孔板贴近转移槽的口色端，填满转移缓冲溶液同时防止出现气泡。（3）电转移连接电源，在4°C条件下维持恒压100v,1小吋。3••免疫检测（1）膜染色断开电源，将转移盒从转移槽屮移岀，将转移盒的各个部