Microbiology technology

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1、Module1：微生物学研究与应用技术一、PCR技术1、PCR原理：PCR技术是以DNA双链的复制和变性、复性为原理，在人工调控的温度下，提供DNA复制所需的引物、模板、dNTPs、聚合酶等条件，从而使得DNA可周而复始的进行复制扩增。2、PCR循环（步骤）：变性（denaturation）—退火（annealing）—延伸（extension）；变性：高温下，模板DNA发生热变性，双链解开成两条单链；退火：反应体系降温，使引物与模板DNA两端的碱基配对；延伸：DNA聚合酶使引物3’端向前延伸合成新链；新合成的单链又可作为下一轮循环的模板进行复制，并不断重复上述的3个步骤

2、，使得DNA片段呈指数增长，在1h内可重复25~30次，DNA的扩增量可达106~107倍。3、PCR常用的耐热聚合酶：（1）TaqDNA聚合酶，耐高温但缺乏校正功能，使用最为广泛；（2）PfuDNA聚合酶、VentDNA聚合酶，既耐高温又具有校正功能的聚合酶；（3）TthDNA聚合酶，具有逆转录活性的聚合酶，可使RT-PCR在同一体系中进行，即使仅有极少量的RNA也可被扩增，可用于研究细胞RNA和RNA病毒。4、PCR的应用：（1）可用于基因的扩增和制备DNA探针，如已知目的基因两端的序列，利用PCR便可将其扩增出来，也可用于定位诱变和DNA测序；（2）可用于临床医学上

3、检测传染病、诊断遗传病和分析癌基因；（3）在法医上可用于进行亲子鉴定、个体鉴定等。5、PCR定位诱变技术（最常用）：任何基因只需要知道两端及需要的变异部位的序列即可进行PCR定位诱变。PCR诱变有两种方法：（1）基因末端诱变：5‘端或3‘端引物含有变异碱基，便可使PCR产物的末端引入变异。（2）基因中部诱变：在需要诱变的位置合成一对含有变异碱基的互补引物，然后分别于5’端引物和3’端引物进行PCR，这样便可得到两个含变异碱基的PCR产物，由于二者中间有一段序列彼此互补重叠，在重叠部位经重组PCR就能得到变异的PCR产物。图P273二、革兰氏染色法基本原理方法：通过结晶紫初

4、染和碘液媒染后，在细胞膜内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物（CVI）。革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚，肽聚糖网层次多和交联紧密，故遇乙醇处理时不会溶出缝隙，因此能把结晶紫与碘的复合物牢牢地留在壁内，是其保持紫色。反之，革兰氏阴性菌因为细胞壁薄，外膜层的脂类含量高、肽聚糖层薄和交联度差，所以在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能截留结晶紫-碘复合物的溶出，因此，通过乙醇脱色后细胞退为无色。这时再经过沙黄等红色染料进行复染，只有革兰氏阴性菌会被染成红色。三、常用基因工程载体1、克隆载体：是指负责将外源基因运送到宿主细胞内进行复制与扩增的运输工具。2、作

5、为克隆载体的要求：（1）载体应为一个独立的复制子，含有复制起始点且可在细胞内自主复制；（2）含有多克隆位点，即含有若干限制酶单一切点，以便插入外源基因；（3）含有选择标记，便于对阳性克隆的筛选和鉴定；（4）具有一定的安全性，在胞内不发生重组和转移，在胞外也不能自由扩散。3、基因工程常用的5大载体：质粒载体、ƛ噬菌体载体与黏粒载体、M13噬菌体载体与噬菌粒载体、真核生物克隆载体、人工染色体。1、主要克隆载体及其主要用途：一、细菌质粒载体—外源基因的克隆与表达，<15kb；二、噬菌体载体—构建基因文库及cDNA文库，<23kb；三、黏粒载体（柯斯质粒载体）—构建基因文库，<4

6、9kb；四、M13噬菌体载体—单链DNA制备和测序、定位诱变、噬菌体展示，300~400bp；五、噬菌粒载体—外源基因的克隆与表达，<10kb；六、酵母质粒载体—真核基因的克隆与表达，<15kb；七、Ti质粒载体—植物基因工程载体，<20kb；八、酵母人工染色体（YAC）—大基因簇相关功能基因研究、实现人类基因组计划和人类疾病相关基因研究、构建真核生物大片段基因文库，100~2000kb；九、细菌人工染色体（BAC）—同上，120~300kb；2、载体对表达宿主的基本要求：（1）能够高效吸收外源DNA；（2）不具有限制修饰系统，不降解导入的未经修饰的外源DNA；（3）不具

7、有DNA重组系统，常用重组缺陷型（recA-）菌株；（4）根据载体类型选择相应宿主：如用ƛ噬菌体或黏粒作为载体，须选择ƛ噬菌体敏感的宿主（E.coli-K12）；选用M13时，则应选择含有F因子的雄性大肠杆菌为宿主；（5）根据载体的标记选择合适的宿主，例如载体携带氨苄青霉素抗性基因作为选择标记，则应选择氨苄青霉素敏感菌株为宿主；（6）具有安全性，宿主细胞应该对人、畜、农作物无害。6、各种常见载体的特点特性：（1）质粒载体：含有复制起点；含有多种限制酶的单一识别位点；含有抗生素抗性基因的选择标记；高拷贝，每个细胞含有10~200