细胞培养基技术

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1、细胞培养基本技术细胞培养的甚本概念¢传代：¢细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。¢原代培养¢取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。¢¢细胞培养：使用单个细胞悬液¢组织培养：使用组织块（O.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2毫米）¢器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫原代培养细胞的生命归宿¢原代培养期¢传代期¢衰退期¢有限细胞系，无限细胞系¢细胞系cellline¢细胞株cellstrain培养细胞的特性¢培养细胞的生长方式¢贴附生长：¢必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞¢悬浮生长：¢于悬浮状态下即可生长，不需要贴

2、附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞每代贴附生长细胞的生长过程¢游离期¢贴壁期¢潜伏期¢对数生长期¢停止期（平台期）¢游离期：¢细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。¢10分钟一4小时¢贴壁期：¢细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。¢底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等¢血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。¢进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）¢潜伏期¢此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜

3、伏期一般为6～24小时。¢对数生长期：¢细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。¢停止期（平台期）：¢细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂¢机制：接触抑制、密度依赖性培养细胞生长的条件¢1细胞的营养需要¢2细胞的生存环境¢温度:37℃¢O2+-¢CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H+HCO3¢pH:7.2-7.4¢渗透压¢3无污染¢4无毒实验准备实验用品：¢超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸¢CO2培养箱¢倒置显微镜¢酶标仪、微孔板震荡器¢液氮罐¢自动双重纯水蒸馏器，纯水仪¢耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管¢压力蒸汽消毒器：湿热

4、消毒，用途广¢电热干燥箱：干热消毒（160℃，2小时）。主要用干玻璃¢器皿消毒¢滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、¢酶液等均采用滤过法除菌¢超净工作台：为细胞操作提供无菌环境¢紫外灯：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料¢培养皿和培养板等表面消毒超净台¢超净工作台的工作¢原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。滤器CO2培养箱¢CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO。2¢使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：¢①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。¢②保持培

5、养箱内空气干净。定期消毒¢（90℃，14h)。¢③箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。自动双重纯水蒸馏器纯水仪酶标仪微孔板震荡器培养板培养瓶¢常用玻璃器皿清洗¢浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、¢流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50℃烘干清洁液的配制细胞培养用液的配制水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNaHPO.HO1.56g242KHPO0.2024加水至1000ml消化液：¢胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细

6、胞分离¢胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。¢胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。用滤器过滤除菌。¢胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。¢用含血清培养液终止其对细胞的消化作用培养基¢培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。¢天然培养基：¢天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。¢优点：营养成分丰富，培养效果好¢缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染¢合成培养基:¢合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，

7、用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。¢合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。¢优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低¢缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。¢人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。¢血清中含有：¢①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）¢②多种金属离子；¢③