糖尿病性视网膜病变血管内皮生长因子与糖基化终末产物的关系

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1、糖尿病性视网膜病变血管内皮生长因子与糖基化终末产物的关系【摘要】目的研究糖尿病性视网膜病变(DR)血管内皮细胞生长因子(VEGF)与蛋白质糖基化终末产物(AGEs)的关系。方法建立糖尿病大鼠模型，随机分为正常对照组(M)，糖尿病1个月组(M1)、3个月组(M3)、5个月组(M5)。在不同时间点取视网膜，在视网膜切片上行VEGF免疫组化，同时在透射电镜下观察各组视网膜超微结构，并检测动脉血清中AGEs水平。结果视网膜VEGF免疫组化染色显示，M3组VEGF阳性表达率为33.3%，M5组为88.9%;VEGF免疫组化阳性组的AGE

2、s水平(91.31±17.28)高于阴性组(68.60±14.38)，差异有统计学意义(F=5.80，P=0.0294)。M1组与M组相比AGEs水平增加，但差异无统计学意义(P>0.05)，而M3、M5组与M组相比AGEs水平明显增加(P<0.05,P<0.01)。透射电镜观察:M组未见视网膜微血管异常改变,从M1组开始出现异常改变,以M5组最明显，表现为基底膜节段性增厚，内皮细胞肿胀变形，周细胞核异染色质浓集居边,线粒体肿胀变性,甚至呈空泡状。结论糖尿病视网膜病变模型AGEs水平升高与VEGF表达增强一致。【关键词】糖尿病

3、性视网膜病变;血管内皮细胞生长因子;免疫组化;超微结构;蛋白质糖基化终末产物糖尿病性视网膜病变(DR)是一种以微血管病变为主的致盲性眼病。研究表明，糖基化终末产物(AGEs)在疾病早期沉积于血管内皮细胞，引起微血管的一系列病变，是DR损害的一个主要因素。而血管内皮生长因子(VEGF)被公认是DR新生血管生成的重要因子，本文就两者的关系进行观察，以进一步探讨DR的发病机制。1材料与方法1.1糖尿病动物模型的建立及分组体重180～200g雄性Wistar大鼠55只，由本校实验动物部提供，适应性饲养3d后用于本实验。选取其中45只随

4、机分成3组：1个月组(M1)，3个月组(M3)和5个月组(M5)，每组15只，腹腔注射链脲佐菌素(STZ)60mg/kg体重(溶于新配制的0.1mol/LpH4.3柠檬酸钠缓冲液中)以诱发糖尿病;另外10只作为正常对照组(M)，仅注射同样体积的柠檬酸缓冲液。注射STZ3d后测尿糖及血糖,以尿糖以上,空腹血糖>16.5mmol/L;尿量及饮水明显增多者列入糖尿病实验对象,实验期间大鼠正常饮食饮水,定期测血糖、尿糖及体重，去除中间死亡和血糖恢复大鼠，每组以9只大鼠作为实验统计样本，过量麻醉处死大鼠，在腹主动脉取血留血清，于-20

5、℃冰箱备测AGEs，轻摘眼球。右眼用于VEGF免疫组化，左眼用于电镜观察。1.2方法1.2.1组织学处理将右眼球固定于10%中性甲醛中48h，乙醇常规脱水，二甲苯透明后浸蜡包埋。连续6μm厚切片用于免疫组化。1.2.2免疫组化染色步骤免疫组织化学染色采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法(S-P法)，操作步骤如下：(1)切片常规脱蜡、脱水。(2)磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗5min。(3)3%H2O2-蒸馏水阻断内源性过氧化物酶25min。(4)PBS冲洗5min，3次。(5)抗原修复。(6)山羊血清(1∶20)封闭30

6、min。(7)特异性一抗于切片上，孵育40min。(8)PBS冲洗5min，3次。(9)滴加相应的二抗(IgG或Biotin)，孵育40min。(10)PBS冲洗5min，3次。(11)加相应的三抗(S-A/HRP)孵育40min。(12)PBS冲洗5min，3次。(13)二氨基联苯胺(DAB)-蒸馏水溶液显色。(14)Mayer苏木精复染,二甲苯透明,中性树胶封片。1.2.3电镜标本制备(1)左眼球摘除后马上去掉眼前节，浸入2.5%戊二醛溶液中，轻取视网膜，铺于滤纸上。(2)4%戊二醛前固定1h。(3)PBS冲洗2h。(4)

7、1%锇酸后固定1h。(5)系列酒精脱水。(6)Epon环氧树脂812包埋。(7)聚合35℃、45℃、55℃各12h。(8)半薄切片光学定位(1μm)。(9)瑞典产LKBⅢ型超薄切片机切片(70nm)。(10)醋酸铀枸橼酸铅染色。(11)日本产JEM-1200EX透射电镜观察、拍片。1.2.4AGEs测定正常对照组(M)，糖尿病1个月组(M1)、3个月组(M3)、5个月组(M5)分别在腹主动脉取血留血清于-20℃冰箱备测AGEs水平。采用日本岛津公司生产的FR.540型荧光分光光度计测定AGEs水平,激发波长370nm，发

8、射波长440nm，灵敏度1，狭缝10nm。AGEs水平以任意荧光单位表示。1.3统计学分析采用SAS6.12统计软件。AGEs在四个组的水平比较采用单因素方差分析，多重比较采用Tukey检验。VEGF免疫组化在M3、M5组间的比较用两因素方差分析。2结果2.1VEGF免疫组化