N-羟基琥珀酰亚胺-荧光素-O-乙酸酯柱前衍生HPLC分离荧光检测肽及其水解产物

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1、N-羟基琥珀酰亚胺-荧光素-O-乙酸酯柱前衍生HPLC分离荧光检测肽及其水解产物【关键词】高效液相色谱法摘要探索了N-羟基琥珀酰亚胺-荧光素-O-乙酸酯（SIFA）与氧化型谷胱甘肽（GSSG）、三甘肽（Gly-Gly-Gly）、二甘肽（Gly-Gly）和组成它们的氨基酸-谷氨酸（Glu）、胱氨酸（Cys2）、甘氨酸（Gly）反应的衍生条件以及其衍生物的色谱分离条件。于含pH8.5的0.2mmol/LH3BO3-Na2B4O7缓冲溶液中衍生25min，衍生反应液直接进样，采用C18柱，以含42%甲醇的pH5.010mmol/LH3cit-Na2HPO4缓冲溶液为流动相，在λex/λe

2、m＝492/513nm处荧光检测，分离测定了六种肽及其组成氨基酸的衍生物，检出限为0.64～12fmol。该方法具有流动相体系简单、灵敏度更高等优点。关键词高效液相色谱法；N-羟基琥珀酰亚胺-荧光素-O-乙酸酯；荧光衍生试剂；肽N-hydroxysuccinimidylfluorescein-O-acetateasafluorescentderivatizingreagentforoligopeptidesandtheirhydrolysatesAbstractSomeoligopeptidesandtheirhydrolysatessuchasGSSG,Gly,Gly-Gly,G

3、ly-Gly-Gly,Gluand(Cys)2wereseparatedanddeterminedbyHPLC-fluorescentusingSIFAasprecolumnderivatizingreagent.ThefluorescentpropertiesofSIFAanditsderivativeswereexamined,andtheeffectsofthepHvalueandCH3OHconcentrationwerestudies.IntheCH3OH-H2O（7:3,V/V）solutioncontainingpH8.5H3BO3-Na2B4O7buffer,SIF

4、Awasderivatizedat30℃for25min.TheresultingfluorescentderivativeswereseparatedonaC18columnusingφ(CH3OH)=42%solutioncontaining10mmol/LH3cit-Na2HPO4（pH5.0）asthemobilephaseanddetectedspectrofluorimetricallyat513nmwithexcitationat492nm.Thedetectionlimitswas0.64～12fmol（S/N=3）.KeywordsHPLC；N-hydroxysu

5、ccinimidylfluorescein-O-acetate（SIFA）；fluorescencedetection;peptide近10年来，与生命科学有关的生物活性肽的研究日益受到人们的重视。高效液相色谱―荧光检测由于具有较高的灵敏度和选择性，成为目前分离和检测肽的一种十分有效的技术，并在肽分析中得到广泛的应用［1］。由于除含苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的极少数肽具有微弱的荧光以外，绝大部分肽本身都没有荧光，因此必须进行衍生才能使肽成为荧光检测的化合物。目前常用的荧光衍生试剂有荧光胺、邻苯二甲醛（OPA）、丹磺酰氯（DNS-C1）、荧光素异硫氰酸酯等。OPA和荧光胺虽然灵敏度较高

6、，但是它们的衍生物稳定性较差，且只能与一级氨基化合物反应。DNS-Cl与荧光素异硫氰酸酯虽然都具有能跟一、二级氨基化合物衍生且衍生产物稳定等优点，但DNS-Cl能与醇酚的羟基、巯基以及部分氨基化合物中的咪唑基反应而选择性较差。使用荧光素异硫氰酸酯衍生时需要真空干燥以除去过量试剂，对固定相损害较大而缩短了柱子寿命且操作繁琐。N-羟基琥珀酰亚胺活性酯是一类较新的胺基化合物的衍生试剂。目前报道的主要有6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺甲酸酯（AQC）［2］、N-羟基琥珀酰亚胺-α-(9-菲)-乙酸酯［3］、N-羟基琥珀酰亚胺-α-萘乙酸酯［4］、N-羟基琥珀酰亚胺-3-吲哚乙酸酯［5，6

7、］和N-羟基琥珀酰亚胺-9-芴甲基碳酸酯［7］等。这些试剂与氨基具有较强的选择性反应能力，不与羟基、巯基等反应，过量试剂迅速水解，干扰较少等优点。我们首次合成的新荧光衍生试剂N-羟基琥珀酰亚胺-荧光素-O-乙酸酯（SIFA）［8］，由于荧光素具有很强的荧光，因而极大提高了其检测灵敏度，同时也保持了其对胺基反应的良好选择性。1实验部分1.1仪器与试剂LC-6A高效液相色谱仪（日本岛津），RF-530荧光检测器（日本岛津），CR-3A数据处理器（日本岛津），RF-5000