细胞支原体污染

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1、细胞支原体污染一般情况及预防措施细胞株若受到细菌、真菌、支原体、或是特定病毒等之污染时，会严重的影响实验的结果。而细菌、真菌等之微生物污染时，较易自培养基等的外观变化察觉。但是若受到支原体之污染时，细胞之外观较无明显变化，但是其污染会造成细胞之生长速率缓慢、细胞产生病变之型态改变等等变化。各国细胞库支原体污染的统计表，如下：国家　  受支原体污染(%)  报告年度USA－FDA  15  1993(past30years)USA－ATCC  15-20  1992Japan－(IFO，RIKEN，JCR80~30~

2、22  19811987-19931998Germany－DSM  36  1990-1994Argentina  65  1987Israel  32  1986-1993China  95  1990造成支原体高污染率的原因为：1.支原体size0.1~0.8um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45um）2.支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化3.过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式4.细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染5.研究或操作人员忽略污染问题而支原体污染了来源

3、:1.  已受污染的细胞2.  操作人员的疏失3.  已受污染的培养基、血清4.  操作环境不良、实验器具不洁等由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。但是若是坚持要作去除支原体污染，有以下几种方法，只不过结果会与原始的细胞特性有差异。去除支原体污染：1.抗生素处理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasmaremovalagent，ICN），Ciproflox

4、cin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer）2.Nucleicacidmetabolites：5-bromouracil，Hoechst33258，bromodeoxyuridine3.Anti-sera预防与控制方面可从以下各点加强注意：G设备方面：1.  使用已作支原体测试ok之细胞株2.  于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞3.  使用不添加抗生素的培养基培养细胞G检测方面：定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。G实验操作人员之无菌观念与无菌

5、操作技术之要求有关支原体污染之问题与回答：o应如何避免细胞污染？细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。o如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？直接灭菌后丢弃之。o支原体(mycoplasma)污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。o支原体污染会对细胞培养有何影响？支原

6、体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。o侦测出细胞株有支原体污染时，该如何处理？直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。支原体之检测：***********直接培养法*************·  原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。·  特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。·  缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来(例如M.hy

7、orhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。·  材枓：dextrose、L-arginineHCl、DifcoPPLObroth(Difco0554-17-1)horseserum、15%yeastextractsolution(autoclaved)、Bactoagar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸（厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应用无菌水，每次打开厌氧缸后，用70%ethanol擦拭内壁。）·  培养基制备

8、：基本配方为DifcoPPLObroth(60%),马血清(20%),15%yeastextreatsolution(10%),10xstocksolution(10%)。由于培养时间长，可加入penicillin(50u/ml)至10xstocksolution或加入thalliumacetate(1：2000)至培养基中以防止其它细菌污染。·  10xs