细胞培养中污染支原体的检查

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1、细胞培养中污染支原体的检查作者简介：唐书谦，男，四川省大竹县人，汉，主任技师，主要从皮肤病理、真菌和性病实验论断，已发表论文30余篇。电话：（023）68757599手机号码：13072313298通信作者：伍津津，电话：（023）68757591收稿日期：09.6.12*修回日期：09.6.18排版格式：请严格按照校园网《学报》网页上“最新消息”栏内“《第三军医大学学报》终稿排版格式”排版。尤其注意图片和表格的排版格式，注意分栏。具体模式请参见近期《第三军医大学学报》。√Thedetectionofmycoplasmainfectioninc

2、ellculture唐书谦，伍津津★，杨涛，王兵强，杨桂红（第三军医大学大坪医院皮肤性病科重庆400042）摘要：目的简述本室细胞培养中一种新的？没有写出创新性√探讨简便可靠的支原体污染的检测法。方法收集本室现有不同批次的种子细胞和试剂等，根据检查方法不同分，①DNA荧光染色检查法：包括成纤维细胞（简称Fb）、角朊细胞（简称KC）小牛血清、Vero细胞-1、A549细胞、Vero细胞-2、DMEM完全培养基、DMEM无抗菌素培养基、1640培养基、胎牛血清、鼠尾胶原、牛尾胶原、壳多糖、硫酸软骨素透明脂酸酶、磷酸盐缓冲液、D-Hank`s液等待检

3、标本16种。②培养检查法：包括Fb、KC和小牛血清3种主要标本，采用“精氨酸支原体肉汤培养基”、“支原体半流体培养基”培养法。结果DNA荧光染色法检查16种标本，阳性√阳性为18.75％（3／16）。培养法检查：Fb、KC和小牛血清3种主要标本中，阳性率√为33.3％（1／3）。结论细胞培养中支原体检查方法，DNA荧光染色法较之培养法具有简单、方便，相对需时较短等优点，结果稳定、可靠。关键词：支原体；支原体检查；指示细胞DNA染色方法支原体是细胞培养污染中最常见的一种微生物，受支原体污染的细胞，用于科研或临床都将产生不良的后果。根据文献报导有8

4、7％的不同细胞系受到支原体的污染。其中，精氨酸支原体、发酵支原体、口腔支原体等最为常见。德国微生物和培养细胞保存中心（DSMZ英文全称√）（DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbHDSM）的研究者曾研究显示，世界范围内细胞系的支原体污染率在15%～50％之间[1]。充分说明支原体感染是一个普遍存在的问题，不可忽视。有关支原体的检查方法有多种，如支原体培养法、DNA荧光染色法、DNA杂交法和PCR快速检查法、基因突变细胞检测法等。本文收集了本室现有不同批次的种子细胞和试剂等16种标

5、本，以DNA荧光染色法检查。并同时对FB、KC和小牛血清3种主要的标本作了培养检查法。现将结果和体会报告如下：1材料和方法1.1材料1.1.1添加三级小标题，建议不要标注番号，否则1.1.1～1.1.5均要添加小标题收集本室不同批次之种子细胞和试剂：成纤维细胞（FibroblastFB英文全称√）、角朊细胞（KeratinocyteKC英文全称√）小牛血清、Vero细胞－1（本校微生物教研究室提供）、A549细胞（本校免疫教研究室提供）、Vero细胞－2（上海生物研究所购）、DMEM完全培养基和DMEM无抗菌素培养基（Gibco公司提供）、16

6、40培养基、胎牛血清、鼠尾胶原、牛尾胶原、壳多糖、硫酸软骨素透明脂酸酶、磷酸盐缓冲液、D-Hank`s液共16种。精氨酸支原体肉汤培养基（Mycoplasma(Ma)BrothMediumBase）、支原体半流体培养基（MycoplasmaSemi-FluidBase）。北京三药科技开发公司生产。二苯甲酰胺荧光染料(Hoechst33258)工作液，由碧云天生物技术研究所提供。1.2方法1.2.1DNA荧光染色法[2]1.2.1.1材料准备：取指标细胞（Vero细胞）传代培养，经消化后制成105/ml细胞悬液。然后取6孔或12孔细胞培养板，每孔

7、分别接种Vero细胞0.5ml。并同时再分别加入“无抗菌素1640培养基”。置于5％CO2孵箱(36±1)℃培养过夜，备用。1.2.1.2待检标本培养：将供试待检标本经“无抗生素培养液”培养，并传代至少一次。然后取细胞已长满、且3d未换液的细胞培养上清液2ml，加入上述备用的指示细胞培养板孔内，其它待检标本如培养基等可直接取量加入。然后置于5％CO2孵箱(36±1)℃培养3～5d，至少传代一次，在末次传代时同时作爬片培养3～5d。最后取爬片培养作DNA荧光染色。1.2.1.3DNA荧光染色法:吸出培养孔中的培养液，加入固定液于培养孔内固定爬片5

8、min，然后弃去固定液重新加固定液固定10min，再吸出固定液使细胞爬片在空气中干燥，加二苯甲酰胺荧光染料(Hoechst33258)工作液，室温染色