基因操作原理-孙明

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1、基因操作原理PrinciplesofGeneManipulation绪论一、什么是基因操作将在细胞外产生的核酸分子插入病毒质粒或其它载体系统中再整合到那些本来不含该类物质的宿主中从而形成一种新的可连续繁殖的有机体目的要求掌握基因操作中基本的普遍应用的原理并能自主设计通用操作方法和策略要求的基础生物学生物化学分子生物学参考书籍１.MolecularCloningV2.0,1989分子克隆实验指南2.基因工程原理　第二版（上册）吴乃虎　科学出版社　1998/20003.分子生物学试剂产品目录如NewEnglandBioLabs其它　基因及其操作原理

2、精编分子生物学实验指南Internet１．基因及其产物的共线性２．基因及其产物的非共线性３．基因的重叠与可变性二、基因的基本概念编码区ORF启动子promoterRBSribosomalbindingsite终止区terminatorflankingsequenceupstream/downstreamCap/tail三、基因的基本结构组成酶切酶切连接转化筛选...GAATTC......CTTAAG......G...CTTAAAATTC...G...EcoRI三、基因克隆的通用策略ChromosomeDNAvectorRecombinant

3、plasmidsTargetgene第二章工具酶切割位点可为获得DNA的物理图的特殊的标记利用限制性内切酶切割产生特殊DNA片段的能力使得纯化那些DNA片段成为可能获得的限制性DNA片段可作为DNA操作中的基本介质第一节限制性内切酶Restrictionendonuclease任何物种都有排除异物保护自身的防御机制免疫系统细菌的限制与修饰系统限制性内切酶修饰酶一、限制与修饰Restrictionandmodification50年代初，发现hostcontrolledspecificity噬菌体具有代表性和普遍性其在不同宿主中的转染频率，在

4、感染某一宿主后，再去感染其它宿主时受到限制的现象。E.coliKE.coliCEOP=1EOP=1EOP=1EOP=10-41.现象EOPEfficiencyofplatepfuplaqueformingunitE.coliKE.coliBE.coliCKBC11110-410-410-410-411说明K和B菌株中存在一种限制系统可排除外来的DNA10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果甲基化：AN6甲基-腺膘呤C5‘甲基胞嘧啶2.限制酶的发现60年代，限制内切酶和限制酶的概念1968年首次从E.coliK中分离限制性内切酶需要ATP

5、，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等有特定的识别位点但没有特定的切割位点切割位点达离识别位点1000bp以上1970年美国约翰·霍布金斯大学H.Smith偶然发现流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）能迅速降解外源的噬菌体DNA无细胞提取液可降解E.coliDNA但不能降解自身DNA即HindII酶5’...GTPyPuAC...3’3’…CAPuPyTG...5’GTCGACGTTAACGTCAACGTTGACYR5’...GAATTC...3’3’…CTTAAG...5’EcoRI3.限制酶的命名宿主属名第一字母、种名头两个字

6、母菌株或型号序号罗马字HindIIEcoRI早前加R,orM菌株号和序号小写1986年下半年发现615R98M1998年10000细菌古细菌3000种酶200多特异性3.限制与修饰系统的种类亚单位组成,识别序列的种类,是否需要辅助因子分三类(I,II,III)也有分四类，IIs类，即II亚类(1)typeII93%识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割3’-OH,5’-P，需Mg2+，相应的修饰酶需onlySAM识别序列主要为4-6bp，或更长且呈二重对称的特殊序列但有少数酶识别更长的序列或简并序列切割位置因酶而异，有些是隔开的R:一般为同

7、源二聚体,反向结合作用在两条链M:单体DNA同时切割,M只作用新链typeIIs占5%识别位点非对称,非间断4-7bp切割位点可能在20bp范围内。R:与typeII具有相同的辅助因子要求M:通常由两个M来完成,各作用一条链(2)typeI和typeIIItypeI(1%)种类少如EcoREcoBR酶和M酶各作为一个亚基存在于酶分子中即R基和M亚基，还有负责识别DNA序列的S亚基分别由hsdR，hsdM，hsdS基因编码属于同一操纵子（转录单位）EcoKR2M2SEcoBR2M4S2P1—hsdR—P2—hsdM—hsdS识别位点EcoBTGA

8、*(N)8TGCTA*EcoKAAC(N6)GTGCA*甲基化位点°可能的甲基化位点切割位点1000bp以外,无特异性°°R-M+突变M+S-R-M-