海洋季也蒙毕赤酵母菊粉酶的发酵生产、纯化、特性、基因克隆与表达的研究

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1、中国海洋大学博士学位论文海洋季也蒙毕赤酵母菊粉酶的发酵生产、纯化、特性、基因克隆与表达的研究姓名：龚方申请学位级别：博士专业：海洋生物学指导教师：池振明20080602析发现产物只有单糖。克隆得到了季也蒙毕赤酵母(Pguilliermondii)strain1胞外菊粉酶基因／NU的全长(登陆号EUl95799)，共1542bp，无内含子，根据DNA序列推导出该了菊粉酶前体肽的氨基酸序列，共514个氨基酸，推导分子量为58042Da。利用生物学软件分析菊粉酶基因／NU及其上下游碱基序列，推导出其启动子和终止子位置及结构特点等。

2、分析菊粉酶前体肽氨基酸序列，推测出N端有18个氨基酸残基的信号肽，并含有10个可能的N端糖基化位点，对菊粉酶前体肽氨基酸序列的保守区进行了分析，推测出约在20．300个氨基酸处具有糖苷酶家族N端特性。同时构建pPICZt删表达载体，将克隆得到的strain1菊粉酶基因删在巴斯德毕赤酵母真核表达体系中进行了功能表达。对重组酶进行了进行SDS-PAGE检测和Westernblotting分析，得到了大小为60kD的重组酶条带，并通过免疫印迹证实了菊粉酶基因在真核表达系统中的表达。诱导48h的重组菊粉酶粗酶液酶活为30．74-0．

3、12U／ml，使用薄层层析方法检测重组酶对底物菊粉的水解作用，证明了重组酶对菊粉有一定的水解作用。同时还利用响表面方法(RSM)对海洋季也蒙毕赤酵母strain1的高产菊粉酶突变株M-30的固体发酵条件进行了优化，得到最终的最优条件为初始湿度60．5％，接种量2．5％，麸皮：稻糠：0．42，30oC培养，初始pH6．5。在最优条件下，突变株M-30固体发酵酶活达到455．9U／gds，明显高于原始菌株(29I．0U／gds)，说明通过诱变方法确实使突变株的酶活力明显得到了提高，具有稳定的较高的外切菊粉酶活力。综上所述，本实验

4、对于海洋季也蒙毕赤酵母(Pguilliermondii)strain1菊粉酶的研究较全面系统，对于开发利用海洋酵母茵菊粉酶具有积极意义。关键词：海洋酵母菌，菊粉酶，菊粉，水解，果糖StudyonProduction，Purification，Characterization，GeneCloningandExpressionofInulinasefromMarineYeastPichiaguilliermondiiAbstractInulinisafructosepolymerthatoccursasareservecarbo

5、hydrateinJerusalemartichoke，dahliatubersandchicoryroot．Thispolymerisarecognizedsourcefortheproductionofeitherultra-highfructosesyrups．、^，i也D·fructosecontentover95％orforproductionofoli垒ofructosesyrups．Inulinase(B一2，1一D-fructanfructanohydrolase，EC3．2．1．7)targetsonthe

6、13-2，1linkageofinulinandhydrolyzesitintofructose．Inulinaseisproducedbymanymicroorganisms，includingfungi，yeastsandbacterias．Butlittleisknownaboutinulinaseproducedbymarineyeasts．Marineyeaststrain1whichwasfoundtosecretealargeamountofinulinaseintothemediumWasselectedfr

7、omthecollectioncultureofmarineyeastsavailableinthislaboratory．ThismarineyeaststrainWasidentifiedtobeastrainofPichiaguilliermondiiaccordingtotheresultsofroutineyeastidentificationandmolecularmethods．Theoptimalmediumandcultivationconditionsforinulinaseproductionwered

8、eterminedfirst．Seawatercontaining4．0％(w／v)inulinand0．5％(w／v)yeastextract，cultivatedundertheoptimalconditionofpH8．0，28oCand170rpm．Over60Uml。1ofinu