北美萤火虫荧光素酶在毕赤酵母中的表达、纯化及其特性研究

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1、硕士学位论文北美萤火虫荧光素酶在毕赤酵母中的表达，纯化及其特性研究表达、纯化及其特性研究作者姓名罗展浩学科专业发酵工程指导教师潘力教授所在学院生物科学与工程学院论文提交日期2018年6月Studiesonexpression,purificationofrecombinantPhotinuspyralisluciferaseinPichiaPastorisandit’scharacteristicsADissertationSubmittedfortheDegreeofMasterCandidate：LuoZhanhaoSupervisor：Prof.PanL

2、iSouthChinaUniversityofTechnologyGuangzhou,China分类号：Q81学校代号：10561学号：201420125148华南理工大学硕士学位论文北美萤火虫荧光素酶在毕赤酵母中的表达、纯化及其特性研究作者姓名：罗展浩指导教师姓名、职称：潘力教授申请学位级别：工学硕士学科专业名称：发酵工程研究方向：发酵与生化工程论文提交日期：2018年4月14日论文答辩日期：2018年6月1日学位授予单位：华南理工大学学位授予日期：年月日答辩委员会成员：主席：林影教授委员：林炜铁教授、李爽教授、崔堂兵教授、梁书利副教授摘要食品安全问题是全球

3、人类共同面对的和亟待解决的难题之一，其中控制由微生物污染造成的食品安全问题，又是其中最重要的一项议题。ATP快速检测技术，能对食品的微生物ATP提取和检测，能够在几十分钟内，获取污染微生物的检测结果。荧光素酶则是ATP快速检测技术的核心组件，因此该酶的需求与日俱增。北美萤火虫荧光素酶，是商业化的荧光素酶，通常用作报告基因或活体生物荧光成像技术，也用于ATP快速检测。已有大肠杆菌生产该荧光素酶的相关研究，但是该系统不能将酶直接分泌到胞外，而且培养过程需要添加抗生素维持遗传特性，单位体积发酵液产量不高等。据此本研究旨在将常用的北美萤火虫荧光素酶，使用毕赤酵母这真核

4、系统解决此类问题，以期为最终规模化制备荧光素酶提供理论和技术支持。首先，根据北美萤火虫（Photinuspyralis）的序列，设计引物从报告基因载体pGL2-control上克隆荧光素酶基因luc，构建诱导型表达载体pPIC9K-luc和pPICZαA-lucM，并且转化其宿主PichiapastorisGS115获得高效表达荧光素酶的重组菌GS115/pPIC9K-luc和GS115/pPICZαA-lucM，胞外、胞内具有较高的荧光素酶活性。SDS-PAGE鉴定荧光素酶的分子量分别为70kD和75kD。利用超滤、阴离子交换层析和分子筛层析纯化无标签的荧光

5、素酶（前者表达株），获得68mg/L产量的荧光素酶，8回收率为35%（胞外）、33%（胞内），最大酶比活可达7.00×10RLU/mg；利用镍亲和层析柱和超滤纯化带组氨酸标签的荧光素酶（后者表达株），获得88mg/L产量的荧光9素酶，回收率为55%（胞外）和53%（胞内），最大比活达到7.12×10RLU/mg。继而对纯化的带标签的荧光素酶进行去糖基化分析、基本酶学特性分析，发光体系优化和稳定性等进行了初步研究。发现该酶的糖基化程度为13.3%，酶对底物ATP和荧光素的结合常数Km分别为100μmol/L和17.5μmol/L，最小能够检出1fmol的ATP，

6、最适反应温度为34℃，最适反应pH为7.8。同时考察了100μl反应体系中底物荧光素、发光增2+强剂DEAE-dx、α-环糊精、Mg的最佳浓度为0.035mmol/L、0.04%、0.2%、0.15mmol/L，发光强度提高2.7倍。在上述基础上，最后考察了海藻糖、DTT、甘油和BSA对酶的保护作用，最佳保护浓度为0.2mmol/L、0.5mmol/L、5%、1%，保护效率为75%。本研究成功地使用毕赤酵母表达系统，对荧光素酶进行了表达、纯化，并且完成酶的基本特性和稳定性分析研究，为日后规模化生产奠定基础。关键词：荧光素酶；毕赤酵母；诱导表达；生物发光IABS

7、TRACTFoodsafetyisacommonproblemfacedbyallhumanbeingsaroundtheworldandthecontroloffoodsafetyissuecausedbymicrobialcontaminationisthemostimportantpart.WiththehelpofATPrapiddetectiontechnology,thecontaminatedmicrobialATPcanbeextractedanddetectedintensofminutes.Luciferaseisthecorecompon

8、entofATPrapiddetect