新型双相生物陶瓷构建组织化人工骨及其应用于兔腰椎横突间融合的实验研究

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1、中山大学博士学位论文新型双相生物陶瓷构建组织化人工骨及其应用于兔腰椎横突间融合的实验研究姓名：龙厚清申请学位级别：博士专业：外科学（骨科）指导教师：李佛保;王迎军2003.5.8新型双相生物陶瓷构建组织化人工骨及其应用于兔腰椎横突问融合的实验研究中文摘要新型双相生物陶瓷构建组织化人工骨及其应用于兔腰椎横突问融合的实验研究专业：外科学(骨科学)博士生：龙厚清指导教师：李佛保教授、王迎军教授中文摘要目的：①观察和比较新法制备的三种钙磷陶瓷材料羟基磷灰石(HA)、磷酸三钙(TCP)、双相陶瓷HA／TCP的形貌特征及其复合rhBMP．2体内异位成

2、骨的差异，为构建组织工程化人工骨载体材料的选择提供依据；②探讨兔骨髓基质细胞(MSCs)体外分离纯化、培养扩增、向成骨细胞诱导分化的条件以及rhBMP一2在诱导分化中的作用，比较两种诱导方法的差异，建立兔骨髓来源成骨细胞系，用以作为构建组织工程骨的种子细胞；③利用组织工程学原理和方法，体外构建细胞复合型植骨材料即组织化人工骨：④了解支架材料的细胞相容性和复合骨的体内、外成骨活性，探讨新型双相生物陶瓷材料(HA／TCP)作为骨组织工程支架材料复合兔骨髓来源成骨细胞的可行性及其成骨能力；⑤评估这种新型植骨材料应用于兔腰椎横突间融合的效果，并与

3、自体骨、单纯支架材料植骨相比较，探讨这种新型植骨材料用于脊柱融合的骨愈合生物学特点和机制，比较x线和CT两种影像学方法评估脊柱融合的价值，为骨组织工程支架材料开发、提高对脊柱融合生物学过程及其机制的认识、评价脊柱融合影像学方法的正确选择等提供理论依据和临床参考。／f方法①扫描电镜观察新型支架材料的形貌特征，通过组织学和组织计量＼新型双相生物陶瓷构建组织化人-丁骨及其应用于兔腰椎横突问融合的实验研究中文摘要学比较新法制备的HA、TCP、HA／TCP三种生物陶瓷复合rhBMP．2体内异位成骨的差异，筛选最佳支架载体。②利用梯度离心和细胞培养技

4、术对兔骨髓基质细胞进行分离、纯化、体外扩增，并利用两种方法向成骨细胞诱导分化：比较用含有地塞米松、抗坏血酸和B-甘油磷酸钠的常用诱导剂(A)和常用诱导培养基中加有rhBMP-2的改良诱导基(B)向成骨细胞诱导分化的差异，建立稳定的、符合骨组织工程对种子细胞要求的骨髓来源成骨细胞系。③将筛选获得的双相生物陶瓷HA／TCP作支架材料、改良诱导方法获得的骨髓来源成骨细胞作种子细胞，体外联合培养，构建组织化人工骨，并通过细胞计数、细胞增殖率和碱性磷酸酶测定等观察共孵育后体外细胞增殖和细胞功能状况、了解支架材料的细胞相容性。④将兔骨髓来源成骨细胞与

5、新法制备的HA／TCP共培养12天，通过相差显微镜、扫描电镜观察体外细胞生长情况；然后将复合物同基因植入体内(异位肌袋成骨模型)，6周后通过组织学、组织化学和组织计量学观察体内成骨情况和支架材料变化，了解其组织相容性。⑤利用兔腰椎横突间融合模型，将47只新西兰大白兔根据植骨材料随机分为A(自体髂骨)、B(组织化复合骨)和C(单纯支架)三组，每组15只。分别于术后2、6、12周处死动物3、3、9只，将腰椎取出，通过大体标本观察、影像学、组织学、组织化学和生物力学等方法分析评估各组融合状况，初步了解不同植骨材料用于脊柱融合的骨愈合生物学机制；

6、以实体标本观察结果为标准，比较X线和CT两种影像学方法评估脊柱融合的敏感性和特异性差别。结果①扫描电镜观察显示，新法制备的钙磷陶瓷材料平均孔隙率在70％以上，微孔直径分布在200～300Ilm，大孔附壁上有小孔，其间有互相贯通的微孔，表面粗糙。HA、TCP、HA／TCP复合相同rhBMP．2剂量时，植入体内早期即有新骨形成，并随时间推移骨形成增加，早期(2～4周)三者无明显差异，后期(6～8周)以双相陶瓷HA／TCP复合rhBMP．2骨形成最佳，支架材料亦有适量降解，相关参数和图像分析有统计学意义(P<0．05)：单纯支架材料无新骨新型双

7、相生物陶瓷构建组织化人工骨及其应用于兔腰椎横突间融合的实验研究中文摘要形成。②利用梯度离心和细胞培养、扩增、传代技术可得到分离纯化的BMSCs，A、B两种诱导方法均可获得稳定、经过成骨细胞鉴定的成骨细胞系；B法诱导培养后成骨细胞增殖率(峰值提前)、ALP活性均高于A法(户

8、物表面，可见成骨细胞、骨细胞、髓腔样结构、板层样骨基质等正常骨组织结构；术后8周与4周相比，新骨形成面积显著增加(P<0．05)：支架材料面积明显减少，有显著性差异(P<0．05)，内植物中心