斑点免疫技术检测MDR基因疫苗诱导的抗体反应

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1、原创性声明本人声明:所呈交的硕士学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名:户、习飞才，，;又-0_尸日期:夕r9几年_1月户·日关于论文使用授权的说明本人同意学校有权保留并向国家有关部门送交学位论文的复印件，允许论文被查阅和借阅。同意(或不同意)学校及国家有关机构有权公布论文的全部或部分内容，并采用影印、缩印或其他复制手

2、段保存论交。论文作者签名:。、砚劣七指导教师签名:日期‘})-a--A}3,-`,日期:曰州卯3、少~摘要在临床上，许多复发性恶性肿瘤显示对化疗药物的敏感性降低，称多药耐药现象。现已广泛认同:某些转运体蛋白在肿瘤细胞表面的超表达是导致这种现象的原因，其中最常见的是由MDRI基因编码的P一糖蛋白。P-糖蛋白具有水解ATP供能，把化疗药物主动转出胞外的作用。通常P-糖蛋白以极低水平表达于正常细胞:由于这一特性，P-糖蛋白被认为可能作为肿瘤免疫治疗的候选靶抗原。本研究的目的是:构建MDRI基因疫苗并通过免疫实验动物，检测血清抗体效价;分析该基因疫苗诱导体液

3、免疫应答的效应。方法:采用PCR方法分别由MDRI克隆载体扩增编码P一糖蛋白完整分子和其胞外功能区的基因片段，并定向插入真核表达质粒的多克隆位点中，构建可表达功能性P-糖蛋白的转染质粒pMDRIF和基因疫苗pMDRIEx。以限制性内切酶反应和测序鉴定这两种重组子.磷酸钙共沉淀法将pMDRIF转染至K562细胞，并用P-糖蛋白标准单克隆抗体进行对转染细胞的免疫印迹检查。编码P-糖蛋白胞外区的基因疫苗pMDRIEx混合于20%的铝佐剂，两次肌肉注射免疫小鼠.末次免疫后7天收集免疫血清。以pMDRIF转染细胞或对照K562细胞裂解物为抗原，加样于硝纤膜固相

4、化，采取免疫斑点和斑点酶联免疫吸附两种方法分析特异性抗体的血清效价.结果:按照genBANK的图谱，MDR-1基因编码序列全长4.6kb。电泳显示PCR扩增的MDRI全长片段近5kb;P-糖蛋白胞外区的编码顺序预期948bp,在电泳图上位于lkb处。经定向插入到pcDNA3真核表达载体并转化宿主菌，获得了相应的真核表达重组子。限制性内切酶单酶或双酶消化产生的电泳区带均位于预期位置，表明克隆构建成功。测序结果显示除两个连续碱基变异，导致145位密码子点突变外，其余核昔酸顺序与genBANK图谱完全一致。MDRI全长序列的真核表达质粒pMDRIF转染K5

5、62细胞后，以商品化抗P-gp为探针行免疫组化分析:显示P-糖蛋白的膜表达(未显示)。细胞裂解物经SDS-PAGE，电转移至硝纤膜;以市售标准单抗标记酶染。在高分子量区域出I现染色区带，表明P-糖蛋白的表达。P-糖蛋白是胞膜抗原，其特异性抗体检测可以应用免疫组化技术。然而这种方法不适于较大样本测量。本研究建立免疫斑点和斑点酶联免疫吸附实验，作为鉴定细胞表达抗原特异性抗体水平的方法.研究表明这两种方法的非特异性背景染色均低:K562细胞分裂物不能被免疫血清酶染着色。ELLSA检测对照样品OD值一般小于0.1，重复性良好。PMDRIF转染的K562细胞表

6、达P-糖蛋白，免疫血清中含有的特异性抗体可与之结合而酶染显色。两种方法的敏感性相同，均为1:2000倍稀释免疫血清。结论:免疫斑点和斑点酶联免疫吸附试验具有非特异性背景低，灵敏性良好的特点，是可用于大样本细胞抗原特异性抗体检测的可靠方法。第一章多药耐药基因的研究概述肿瘤化疗失败的原因之一是肿瘤细胞对多种细胞毒药物的敏感性下降。其特点是对多种化学性质、生物作用不同的多种化疗药物表现抵抗，称为多药耐药性(multidrugresistance,MDR)。在体外，无论造血细胞或上皮性传代肿瘤细胞系，均能人工诱导MDR。方法是在培养中由远低于IC50的药物浓

7、度开始，逐渐提高化瘤药物浓度，直至细胞可在明显大于IC50的药物浓度下仍能正常生长。常用诱导MDR的药物如长春新碱或阿霉素等。大量研究证明一种称为P粒蛋白(P-9)的跨膜蛋白超表达为导致MDR的主要原因.人类Pgp由大约1300个氨基酸组成。分子内1^-637和638^-1280为两个存在大量重复氨基酸顺序的区域，这两个重复的肤链顺序各包括6个疏水跨膜区和一个细胞内ATP结合位。其中四处同源程度奇高，分别是529-591与1174-1236区，62个氨基酸中有56个相同残基;419-446与1061-1088区，27个氨基酸中有21个相同残基。ATP

8、结合域位即于其中。P-gpl2次跨膜。每一疏水跨膜区都由21个氨基酸组成D1。在结构上，Pgp包括一个主要的