免疫学检测与抗体技术

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1、免疫学检测与免疫学技术一、抗原抗体的检测技术二、免疫细胞的检测三、细胞因子的检测四、免疫相关基因分析五、免疫标记技术六、免疫PCR(IM-PCR)技术七、杂交瘤技术与T细胞克隆技术八、新型抗体的制备技术九、抗原的制备技术一、概述免疫学检测是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验手段及分子生物学技术在免疫学研究中的应用。免疫学技术的应用极为广泛,疾病的诊断、疗效评价及理论研究等。二、抗原抗体的检测技术*根据反应的基本原理与表现主要分为凝集反应、沉淀反应和补体参与的各种反应*根据抗原抗体反应设计的试验还有标记抗原(或抗体)检测相应物质的标记

2、技术。对机体参与免疫应答的细胞进行鉴定,计数及功能测定(一)细胞计数1.荧光抗体染色2.免疫酶染色技术:*ABC法*APAAP法3.免疫金银染色法(IGSS)4．免疫细胞化学法5．四聚体法6．TCR链测定三、免疫细胞的检测(二)免疫细胞功能的测定1.T细胞功能测定：肿瘤，病毒感染，免疫缺陷，自身免疫病等(1)细胞增殖(转化)试验：可分为非特异性丝裂原和特异性抗原两类。*丝裂原主要有PHA、ConA和PWM；*抗原刺激物有破伤风类毒素、PPD和白色念珠菌等；*同种MHC及抗CD3单抗等*肿瘤细胞-自体淋巴细胞混合培养(2)T细胞介导的细胞毒试验：CTL(3)分泌功能检测(

3、4)T细胞功能的体内检测法*接触性超敏反应*移植物抗宿主反应(GVHR)*迟发型超敏反应(DTH)2.B细胞功能判定(1)B细胞增殖(转化)试验：*PWM、SAC，LPS（对小鼠B细胞）；*抗IgM抗体及EB病毒等(2)溶血空斑形成试验(3)反向溶血空斑试验(4)酶联免疫斑点法(ELISPOT):ELISPOT是一种可检测抗体分泌细胞，又可测定抗体分泌量的体外实验方法。*此法的主要优点是:①稳定、特异，且抗原用量少；②可同时检测不同抗原诱导的抗体分泌，并可定量测定；③可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。3.NK细胞活性测定体外检测NK细胞活性的方法有形态学检查法，放射性核

4、素释放法，酶释放法，化学发光法及流式细胞术等。测定人NK细胞活性常以K562细胞株作为靶细胞，测定小鼠NK细胞活性常用YAC－1细胞为靶细胞。(1)形态学检查法(2)放射性核素释放法：用放射性核素(51Cr、125I－UdR)标记靶细胞。(3)酶释放法：测定靶细胞膜受损后从胞浆内释放至介质中的乳酸脱氢酶(LDH)活性。*NAG酶荧光比色法:NAG酶是细胞浆中存在的一种溶酶体酶,与其底物作用后,生成荧光产物,应用荧光分光光度计测定，敏感性明显高于LDH比色法。而且方法简单，结果稳定，重复性好。(4)化学发光法(5)流式细胞术：应用FCM检测NK细胞活性是根据PI染料排斥法。

5、PI渗入死亡细胞内与DNA和RNA结合，在488nm波长激发下产生绿色荧光。此法既可以测定单个细胞毒活性，也可以用于总细胞毒活性试验。*还可利用荧光染料法,细胞光扫描法，双标记细胞毒法测定细胞毒性细胞的杀伤效应。4．吞噬细胞功能测定(1)中性粒细胞趋化功能测定：一般采用滤膜渗透法(Boyden小室法)或琼脂糖平板法。(2)中性粒细胞吞噬、杀菌功能测定1)显微镜检法2)NBT试验：此项试验是测定中性粒细胞吞噬、杀菌功能的一种简易方法。3)化学发光测定法：中性粒细胞在吞噬过程中出现呼吸爆发,产生活性氧代谢产物。此类活性氧化基团与细胞内杀菌作用密切相关，同时又能激发细胞内某些物

6、质产生化学发光。(4)巨噬细胞细胞毒测定:通常取小鼠腹腔巨噬细胞，以-干扰素为激活剂使其活化，作为效应细胞。用125I-UdR标记的DBA/2小鼠肥大细胞瘤P815作为靶细胞。(3)巨噬细胞吞噬功能测定：中药斑蝥酒精浸液敷贴法诱发无菌性皮炎，从皮肤水泡渗出液中收集巨噬细胞，在体外进行鸡红细胞吞噬试验，计算吞噬率和吞噬指数，作为判断巨噬细胞吞噬功能的指标。四、细胞因子的检测（一）免疫学检测法免疫学检测的基本原理是将细胞因子作为抗原进行定量检测。如免疫斑点法、ELISA法、RIA法和免疫印迹法等均已用于细胞因子的检测。某些细胞因子含量甚微的样品(如脑脊液)可用免疫聚合酶链反

7、应(immuno-PCR)进行检测。（二）生物学测定法根据细胞因子对特定的生物学活性,应用相应的指示系统,同时与标准品对比测定,从而得知样品中细胞因子的活性水平,一般以活性单位(U/ml)表示。靶细胞可直接从组织中分离,如骨髓细胞的集落形成试验和胸腺细胞(脾细胞)的增殖试验,或用体外培养的依赖细胞因子才能生长的细胞因子依赖株及对细胞因子杀伤敏感的细胞作为靶细胞。1.促进细胞增殖和增殖抑制法*多种IL、表皮生长因子、转化生长因子α、神经生长因子、血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子*各种CSF作用于造血系