半夏离体培养研究及遗传转化的初探

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1、西南农业大学硕士学位论文半夏离体培养研究及遗传转化的初探姓名：贾永芳申请学位级别：硕士专业：植物学指导教师：李名扬2003.5.1西南农业夫学二OO三届硕士学位如文摘要半夏离体培养研究及遗传转化的初探√，——_—————-一植物学专业指导教师：硕士研究生：贾永芳李名扬教授(西南农业大学生物技术中心，重庆400716)摘要单子叶植物三叶半夏是天南星科半夏属草本植物，为我国常用的中药材，已有2000多年的用药史。由于三叶半夏自身繁殖系数低，目前药用和出口需要量增大，其野生资源日益枯竭。人工栽培三叶半夏也有30年的历史，但是三叶半夏的生长受周围环境的影响较大，加上各种病害及

2、栽培成本的影响，给人工栽培半夏造成很大的限制。因此通过组织培养对其快速繁殖，以期为其工厂化生产种茁或生产有用的药效成分提供资料。同时，遗传转化的研究为以后提高半夏抗逆性和有效成分含量打下了基础。．本研究建立了三叶半夏的高频再生体系，并对其细胞悬浮培养条件的优化进行了较详细的研究。在此基础上，我们对根癌农杆菌介导的三叶半夏的遗传转化体系进行了初步的探索。匪要实验结果如下：．1．三叶半夏叶盘和叶柄高频再生体系的建立取三叶半夏刚展开的叶片及叶柄，常规消毒后接入含2,4．D／KT,2'4．D／BA，NAA／BA不同浓度组合的MS诱导培养基，15d后伤口处长出愈伤组织，将愈伤接

3、至含不同NAA／BA，NAA／KT浓度组合的MS培养基中，一个月后得到再生小植株。在此实验中得到的最佳诱导培养基是MS+2．0rag／L2，4一D+0．5mg／LKT(简称MSl)，诱导频率80％以上；最佳分化培养基是MS+0．2mg／LNAA+I．0mg／LBA(简称MS2)，不定芽分化率达100％。2．组培与野生半夏成分分析组织培养和野生的块茎分别用80％fV醇、0．2mol／L硫酸、蒸馏水提取内含物，经HPLC分析，比较其图谱表明，组织培养块茎中各成分的总含量高于野生块茎，二者的主成分构成相似。3．细胞悬浮系的建立。取颜色鲜黄的愈伤组织进行悬浮振荡培养。经3--

4、4次继代培养得到分散性好的细胞悬浮系。悬浮培养过程中细胞生长曲线呈S型，培养12-16d达到对数生长期，细西南农业大学二00三届硕士学位论文摘要胞鲜重在第18d达到最大值。悬浮液PH值的变化在对数生长期同生长曲线一致。细胞悬浮液过滤得到的小细胞团接种于MS2分化培养基上，40d后分化出了小植株。4．叶柄、愈伤组织为受体的遗传转化体系的初探取三叶半夏的无菌苗叶柄和愈伤组织或常规消毒后的外植体叶柄，在OD值为O．2的农杆菌液中感染15min，吸干多余菌液，接入MS培养基中，暗处共培养3d，共培养后用含500mg／Lcef的无菌水震荡脱菌2h，再转入MSl+500mg／Lc

5、ef+lOOmg／Lkam培养基上进行诱导筛选，最后将长出的抗性愈伤进行鉴定，GUS基因已经稳定表达。凡；二0，c#譬j}f杜j关键词：三叶半夏晦生悬浮培养根癌农杆菌遗传转化西南农业大学：00三届硕士学位论文AbstractAstudyonregenerationandGeneticTransformationofPinelliaternataBreitMediatedbyAgrobacteriumtumefaciensCandidate：JiaYong-FangAdvisor：Prof．LiMing—yangl(BiotechnologyResearchCenter

6、，Southwe赋AgriculturalUniversity，Chongqing400716)PinelliaternataBreitiSherbaceousmonocolsplantofAl丑eeaePinellia．．ItiSoneoftheChinesetraditionmedicineswithalongmedicalhistoryabout2000years．Theself-propagationcoefficientofPinelliaternataBreitislow,anditcannotmeettheincreasingdemandofapplic

7、ationandexport．Thewildrc$ourc宅ofPinelliaternataBruitisdryingup．Manhascultivateditonlyfor30yem．,andthegrowthofPinelliaternataBreitisgreatlyaffectedbYcircumstance，inadditionthecostofcultivationanddisPAlseaffectedtheyieldofPinelliaternataBruit．So’v帕havepropagateditbytissueculturea