喜树组织培养及遗传转化的研究

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1、杭州师范大学硕士学位论文喜树组织培养及遗传转化的研究摘要喜树（CamptothecaacuminataDecne.）是我国特有植物，分布于长江流域及西南各省。喜树不但是一种优良的绿化树种，还是一种药用价值非常高的药用植物。喜树碱（camptothecin,CPT）是喜树体内发现的唯一通过抑制拓扑异构酶Ⅰ（TopoisomeraseⅠ）而具有抗癌活性的天然植物活性成分。喜树碱及其衍生物已用于多种癌症的治疗，在临床试验上显示了广泛的抗癌活性，但是喜树资源有限，通过基因工程和细胞工程提高喜树细胞药用活性成分含量具有潜在的应用

2、价值和广阔的市场。近年来，随着分子生物学和植物细胞凋亡研究的深入，人们发现细胞凋亡不但是植物体正常生长发育必不可少的组成部分，而且是植物抵御病原体的重要手段。超敏反应（hypersensitiveresponse,HR）是植物细胞为限制病原菌生长的一种细胞凋亡，它引起的细胞死亡还可以激发邻近组织的特异性防御反应和植株的系统获得抗性，从而使植物的次生代谢产物含量增加。目前通过基因工程手段提高喜树细胞药用活性成分含量的研究未见报道。在本研究中，将促进细胞凋亡基因Bax和抑制细胞凋亡基因PpBi-1、ced-9转化到喜树细胞

3、中诱导其表达，测定了非转化喜树细胞和三种转化喜树细胞喜树碱和10-羟基喜树碱的含量，分析了细胞凋亡基因对喜树活性成分含量的影响。实验获得以下结果：1.喜树愈伤组织的诱导与抑制褐化：幼叶外植体的最佳诱导培养基为：SH+NAA2.5mg/L+2,4-D0.5mg/L+6-BA0.25mg/L；种胚外植体的最佳诱导培养基为：MS+2,4-D1.0mg/L+6-BA0.5mg/L。抑制幼叶外植体褐化的方法为：增加外植体大小，吹干培养基表面水分。抑制愈伤组织继代培养褐化的方法为：最佳诱导培养基附加30mg/L抗坏血酸和5g/L活

4、性碳；1次继代后，将质地致密的愈伤组织转移到MS培养基上培养。2.建立了喜树再生体系：种胚的外植体在WPM+NAA1.0mg/L+6-BA5.0mg/L培养基上的芽诱导率最高，为73.88%；喜树无菌苗的茎段最适合诱导再生，在SH+NAA1.0mg/L+6-BA5.0mg/L的培养基上可以诱导成芽，诱导率为42%，平均每个外植体产生4.6个芽；诱导根的最佳培养基为1/2MS+IBA2mg/L。3.建立了喜树细胞悬浮培养体系：挑选疏松愈伤组织接入到WPM+2,4-D1.0mg/L+6-BA0.5mg/L液体生长培养基，接

5、种量10%、蔗糖浓度3%、pH5.5、摇床转速120rpm、25℃下散光培养，7d继代一次，为较好的悬浮培养体系，24d时，喜树细胞增值量达到最大，为接入重量的12.86倍。4.建立了遗传转化体系：取喜树无菌苗的茎段和叶片为外植体，预培养2d，用根癌农杆菌分别侵染，侵染时间为15min，共培养2d，清洗后转到添加头孢霉素500mg/L的培养基，14d时加入筛选压潮霉素10mg/L，1-2个月得到抗性愈伤组织，加入雌二醇10mg/L诱导基因表达，PCR检测表明目的基因已经转化到喜树基因组中，RT-PCR检测表明目的基因可

6、以正常表达。5.建立了喜树碱和10-羟基喜树碱检测方法：建立了高效液相色谱荧光法测定喜树组I杭州师范大学硕士学位论文喜树组织培养及遗传转化的研究织中喜树碱和10-羟基喜树碱含量的方法：使用XTerraRP18柱（5um，4.6×250mm）色谱柱,以乙腈/水=25/75(V/V)为流动相，流速为1.0ml/min，柱温30℃下检测，检测器激发波长为363nm，发射波长为550nm。此方法简单、可靠，分离效果好，专属性强，灵敏度高。6.喜树碱和10-羟基喜树碱的检测：检测了喜树从种子到1年生苗不同组织的喜树碱和10-羟基

7、喜树碱的含量，不同培养基诱导的愈伤组织的喜树碱和10-羟基喜树碱的含量，转基因喜树细胞喜树碱和10-羟基喜树碱的含量。结果表明：不同生长时期喜树苗的组织中CPT含量叶＞茎＞根；不同培养基中SH培养基诱导的愈伤组织中喜树碱和10-羟基喜树碱的含量较高；Bax基因在喜树细胞内表达可以提高喜树碱和10-羟基喜树碱的含量。本实验建立了较好的喜树受体系统、遗传转化体系及喜树碱、10-羟基喜树碱的测定方法，初步鉴定了三个细胞凋亡基因整合到喜树基因组中，并且可以诱导表达，分析了细胞凋亡基因在喜树细胞内的表达对喜树碱及10-羟基喜树碱

8、积累的影响。关键词：喜树，细胞凋亡基因，遗传转化，喜树碱，10-羟基喜树碱II杭州师范大学硕士学位论文喜树组织培养及遗传转化的研究AbstractCamptothecaacuminataDecne.,belongingtonyssaceaefamily,growsinthesouthernChina.Camptothecaacum