哮喘患者支气管肺泡灌洗液中肥大细胞功能特性的研究

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1、中国医科大学博士学位论文哮喘患者支气管肺泡灌洗液中肥大细胞功能特性的研究姓名：谢华申请学位级别：博士专业：内科学指导教师：于润江2002.3.1中文摘要前言：芰气管哮喘(哮喘)是一种常见病、多发病，对人类危害极大。该病影响着：赶约10％的世界人口，在不同的国家或地区其发病率不同。哮喘的发病可能是多个基因与环境因素相互作用的结果。其比较成熟的关于发病机制的理论仍为I型变态反应学说，而IgE依赖性肥大细胞激活是该理论的核心，也正是本文的研究内容。与非哮喘者相比，哮喘患者支气管肺泡灌洗液(BALF)中肥大细胞的数量增多、肥大细胞分泌的组胺和类胰蛋白酶的水平增高。这些现象与气流阻塞程度呈现的正相关

2、，提示肥大细胞激活是哮喘发病机制中关键的一步。这一点也被光镜和电镜下所见到的哮喘患者局部抗原激发后BALF中的肥大细胞脱颗粒现象所证实。然而，人们对于哮喘患者BALF中肥大细胞的功能特征却了解较少。由于直接观察哮喘患者BALF中的肥大细胞对理解哮喘时气道中肥大细胞的作用有极大的意义，故本实验对哮喘患者BALF中肥大细胞的功能特征进行了研究。实验材料和方法一、实验材料：茶碱、腺苷(9一B—D—Ribofttranosyladenine)、腺苷衍生物(NECA：5’一N—ethylcarboxamidoadenosine)、离子载体钙A23187(cI)、I型胶原酶、I型透明质酸酶、青霉素和链

3、霉素、牛血清白蛋白、含25mMHEPES的MEM、绵羊抗鼠免疫球蛋白、extr一抗生物素蛋白过氧化物酶和。一苯二二胺(OPD)均由Sigma公司购得，山羊抗人IgE抗体、组胺酶联免疫试剂盒购于Serotec公司(Kidlington，Oxford，UK)。二二、实验方法1．同意行支气管肺泡灌洗液检查的29名稳定期轻度支气管哮喘患者参与了本研究。2．BALF肥大细胞激发试验：将经OlympusBF光学纤维支气管镜回收的BALF用消毒过的尼龙滤器过滤，并用含2％小牛血清的缓冲液冲洗两次。在取出lO出进行细胞计数后，剩下的细胞再重新悬浮于含钙、镁离子缓冲液中。激发过程在uP4试管中完成，即在预先

4、加完50一抗IsE抗体、cI、腺苷、腺苷衍生物(NECk,)、缓冲液或抗Iv,E抗体七腺苷、抗IgE抗体+茶碱、腺苷+茶碱的试管中分别加入100l出细胞悬液，并在370c水浴箱中培养20分钟。激发反应由向置于冰上的试管中立即加入100一冷缓冲液，并立即离心而终止。上清液与细胞分离后于一200c冻存。3．BALF肥大细胞组胺测定：采用组胺酶联免疫反应试剂盒来检测。其检测方法以100出的标准品、对照品或标本与50一的酰化溶液混匀后，在室温下反应1小时。取50止酰化后的标准品、对照品或标本加入到已包被过抗体的96孔盘内，再于每孔内加入200心酶标物并在4。C条件下培养18小时。洗盘后加200出底

5、物显色，然后用酶标仪以410rim光波长读盘。4．组织中肥大细胞的分离和激活：手术切除的经病理证实大体正常的肺或大肠组织切成小块放入含I型胶原酶和I型透明质酸酶的消化液中在370C摇动水浴箱中分别培养60分钟和70分钟。悬浮的细胞通过滤过器(孔径1001,M)与未消化的组织碎片分离，然后放入含10％小牛血清的培养液中于室温下培养16小时。悬浮的细胞经不含钙、镁离子的缓冲液冲洗两次后，再重新悬浮于缓冲液中。激发过程在LP4试管中完成，即在预先加完501山1抗IgE抗体、cI或缓冲液的试管中加入loo心细胞悬液，并在37。C水浴箱中培养20分钟。激发反应由向置于冰上的试管中立即加入150出冷缓

6、冲液，并立即离心而终止。上清液与细胞分离后于一200C冻存。5．组织中肥大细胞的组胺测定：用以玻璃纤维为基础的荧光方法测定细胞悬液中的组胺水平。6．类胰蛋白酶水平测定：采用酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法以抗类胰蛋白酶血清为I抗进行铺盘，并置于4。C条件下过夜。用3％BSA阻断非特异性蛋白质结合位点后，加入类胰蛋白酶标准品或待测样品，每孔501．1。以抗类胰蛋白酶单克隆抗体为识别l抗使之与标准品或待测样品中的类胰蛋白酶结合，并以生物素结合的羊抗鼠免疫球蛋白为Ⅱ抗与extr一抗生物素蛋白过氧化物酶结合。最后用。一苯二胺显色并用酶标仪以490nm光波长读盘。7．统计学方法：全部统计分析均采

7、用SPSS(Versionl0．0)软件。数据以曼±SEM来表示。P<0．05为统计学上有显著差异。-2·结果1．在哮喘患者BALF中，加入抗IgE抗体浓度低至0．01％时即可诱导哮喘患者BALF中肥大细胞释放21．1％的组胺，而非哮喘者肺和大肠中?1％的抗IgE抗体浓度仅诱导18．5％和16．9％的组胺。将抗IgE抗体浓度从0．01％增加到3％对哮喘患者BALF中肥大细胞的组胺释放量无明显影响。本实验抗IgE抗体对哮喘