HrpX和XccR协同调控野油菜黄单胞菌脯氨酸亚氨基肽酶基因的表达

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1、分类号UDC密级编号中国科学院研究生院硕士学位论文申请学位级别亟±堂焦学科专业名称遣笾堂论文提交日期2012—10—9论文答辩日期2012—10—15薹滥蝴qU-●l_摘要嘲野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestrispv．campestris，Xcc)属于革兰氏阴性菌，能够引起多种十字花科植物黑腐病。在Ycc中存在单拷贝的xccR／pip遗传位点。其中，上游基因xccR编码的蛋白与细菌群体感应转录因子LuxR同源；下游pip基因编码～个重要的致病相关蛋白，脯氨酸亚氨基肽酶(prolineiminopepti

2、dase，PIP)。pip基因启动子长为438bp，通过序列分析，我们发现在p印基因启动子区存在非典型的PIP(plant—induciblepromoter)box序列(TTCGC．N4一TTCGC．N2一TTGCC)，暗示在pip基因的启动子区存在潜在的HrpX蛋白结合位点。已有的研究发现，很多受HrpX调控基因的启动子区均含有保守的PIPbox(序列为TTCGC．N15-TTCGC)，HrpX蛋白特异结合PIPbox而调控相应基因的表达。为了研究pip基因的表达是否受HrpX蛋白的调控，我们首先构建了hrpX缺失突变

3、体，通过在野生型和突变体菌株中测定GUS酶活性检测pip启动子／GUS融合基因的表达水平，结果表明，hrpX基因的突变导致pip基因的表达水平显著降低，这在遗传学上证明pip基因的表达依赖于HrpX蛋白。凝胶阻滞(EMSA)实验证实HrpX能够和包含不完整PIPbox的DNA片段结合，而这种结合可以被冷探针竞争；ChlP(ChromatinImmunoprecipitation)．PCR实验显示加入His抗体的样品能够扩增出特异大小的条带，而未加入抗体的阴性对照组没有扩增出条带，通过这两个实验，我们在分子水平上证实HrpX

4、蛋白在体内和体外均特异性结合pip基因启动子区非典型的PIPbox。本实验室已有的研究发现，pip基因启动子区存在一个与LuxR特异性结合位点luxbox同源性很高的反向重复序列，luxXcbox。XccR蛋白结合在该位点而激活pip基因表达。由于xccR或hrpX单基因缺失突变均造成pip基因表达水平显著下降，因此我们推测XccR蛋白和HrpX蛋白在调控pip基因表达过程中可能存在相互作用。通过HrpX．His和XccR．MBP蛋白的pull—down实验发现，HrpX和XccR蛋白在体外能够形成复合物，暗示这两个蛋白在

5、体内可能协同调控pip基因的表达。综上所述，我们可以得出结论：HrpX能够与pip基因启动子区的非典型PIPbox特异结合；并且在调控过程中，HrpX和XccR蛋白协同诱导p／p基因的表达。另外，为了研究pip基因的转录方式，我们进行了5"-RACE实验。结果显示pip基因有两个独立的转录起始位点，推测pip基因可能应答不同的环境信号而产生不同长度的转录本。我们分别截取两个转录起始位点上游序列(翻译起始密码子上游255bp．438bp和26bp．254bp的序列)命名为P1和P2。P1包含预测的PIPbox；P2包含lux

6、Xcbox。为了验证P1和P2是否具有独立的启动子活性，我们将P1和P2与GUS基因融合，分别在Xcc8004野生型、hrpX禾nxccR一突变体中测定P1／GUS、P2／GUS和Ppip438／GUS融合基因的表达水平。初步结果显示，pip基因可能由一个强启动子(P1)和一个弱启动子(P2)驱动，这两个启动子可能共同参与对p勿基因的精细调控。关键词：野油菜黄单胞菌，脯氨酸亚氨基肽酶，HrpX蛋白，不典型PIPbox，XccR蛋白ABSTRACTJingxiZhang(Genetics)DirectedbyYantaoJi

7、aXanthomonascampestrispv．campestris(Xcc)，aGram—negativebacterium，isapathogenicvariantofXanthomonasspecieswhichisthecausalagentofblackrotdiseaseofcruciferousplants．ThegenomeofXccstraincontainsasinglecopyofxcc剐piplocus．TheupstreamgenexccRencodesaproteinwhichishomolo

8、gouswithbacterialquorumsensingtranscriptionfactorLuxR，andthedownstreamgenepipencodesanimportantpathogenicity—relatedprotein，prolineiminopeptidase(PIP)．B