水稻黄单胞菌的检测方法研究

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1、DissertationfortheDegreeofMasterStudyondetectionmethodofXanthomonasoryzaeDirector:Prof.GenjiaTanMasterCandidate:YunfeiLiMajor:PlantPathologyAnhuiAgriculturalUniversityHefei,Anhui,ChinaJune2013摘要我国杂交水稻技术的研究与应用在国际上居领先地位，杂交水稻种子出口具有比较优势。水稻黄单胞菌的两个致病变种水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)和细菌性条斑病菌

2、(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola)，是水稻上重要的病原菌，引起细菌性病害，许多国家将这两种病菌列为检疫性有害生物，限制从病害的疫区进口水稻种子及稻米。为了维护出口产品形象、保证出口杂交水稻种子质量，本文通过对分离得到的细菌进行16SrDNA测序、分析，并通过田间接种实验验证了分离所得的水稻黄单胞菌；设计特异性引物对黄单胞菌进行鉴定；构建多重PCR体系对水稻样品实施检测。主要研究结果如下：1.16SrDNA序列分析及田间接种试验验证使用通用引物(27f/1492r)，对从叶片中分离得到的3个细菌菌株及抽检水稻种子中分离得到的8个细菌菌株，进行16

3、SrDNA序列扩增，经测序分析，认为菌株ZFL-13及YFL-04为水稻细菌性条斑病菌，菌株ZFL-07、YFL-08为水稻白叶枯病菌。对这4株菌株进行了田间接种试验测定，其结果与16SrDNA序列分析结果一致。2.水稻细菌性条斑病菌的分子检测通过序列的分析比较，以水稻细菌性条斑病菌的脂多糖(LPS)合成基因为基础，合成特异性引物（Xocf/Xocr）,并用这对引物分别对水稻白叶枯病菌菌株、水稻细菌性条斑病菌菌株、水稻种子中分离出的其他细菌进行PCR扩增。结果显示这对引物具有很强的特异性，能够从水稻细菌性条斑病菌菌株中扩增出694bp的条带，而其他菌株则无条带；用无菌水对

4、水稻细菌性条斑病菌菌株（NKY-1）进行梯度稀释，使浓度由1×108cfu/ml至1×101cfu/ml依次递减，以各浓度的菌液作为模板进行PCR扩增，结果显示，能够检测出目标条带的最低菌液浓度为1×105cfu/ml，即理论上反应体系中有100个菌体时就能被PCR检测出。3.构建多重PCR体系通过序列的分析比较，从水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的LPS、conservedhypotheticalprotein等基因专化性位点片段另外设计了2对引物（Xof/Xor及Xoof/Xoor），经PCR验证这两对引物符合要求，将这2对引物与引物（Xocf/Xocr）一起加入到同一

5、反应体系中，通过优化PCR反应条件，成功建立了多重PCR体系，能够I同时检测水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌。可以从白叶枯病菌中扩增出164bp及333bp的两个条带，从水稻细菌性条斑病菌中扩增出333bp及694bp的两个条带，从同时包含两种菌的菌液中扩增出164bp、333bp及694bp的三个条带，能够有效检测这两种菌及其混合菌。利用模拟种子样品进行多重PCR检测，也能得到同样的结果，因此该多重PCR技术能够应用于日常的种子检测工作中。关键词：水稻黄单胞菌；16SrDNA序列分析；多重PCR体系；检测IIAbstractTheresearchandapplicatio

6、nofhybridriceinChinaisintheleadingpositioninternationally,andthus,exportofhybridricehavecomparativeadvantages.TwopathogenicracesofXanthononasoryzaeincludingXanthomonasoryzaepv.oryzaeandXanthomonasoryzaepv.oryzicola,whichwerelistedasthequarantinepestsbymanycountries,arethemostimportantbact

7、erialdiseasesonrice.Inordertomaitantheimageofexportproductsandensurethequalityofexportofhybridriceseeds,thisstudythe16SrDNAofX.oryzaepv.oryzaeandX.oryzaepv.Oryzicolaweresequencedandanalyzed,andtheidentificationofX.oryzaepv.oryzaeandX.oryzaepv.Oryzicolaweretestifiedb