药物在肝微粒体酶的体外代谢研究

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1、药物在肝微粒体酶的体外代谢研究色谱小组：汤明海2016.04.28药物研发过程中可能会遇到的问题•在进行新药（包括中药）研发的历程中，您可能会面临和解决这样的问题:•1.新药前体是否被肝脏药物代谢酶系统代谢，造成口服生物利用度低下？（即体外代谢稳定性评价,Invitrometabolicstabilitystudy）•2.如果新药前体被肝脏显著代谢，是何种酶系参与该新药前体的代谢？（即体外代谢表型的鉴定,Invitrometabolicphenotypeidentification）•3.如新药前体被肝

2、脏显著代谢，其代谢产物是什么，其毒性或药效如何？（即体外代谢产物的鉴定,Invitrometaboliteidentification）•4.新药前体是否能抑制或诱导肝脏药物代谢酶系，进而影响其它药物的药效和安全？（即体外抑制评价和诱导评价,Invitroinhibitionorinductionstudy）•5.新药前体在何种动物代谢特征与人相似，进而为临床前研究的动物选择提供依据？（即体外人和动物代谢特征研究,Invitrometabolismprofilinginanimalsandhumans）

3、P450酶•肝微粒体酶中最主要的是细胞色素P450(CytochromeP450)氧化酶，简称P450酶，酶蛋白中所含血红素与一氧化碳（CO）的结合体P450-CO在450nm处有特征性强吸收峰而得名。它存在于肝细胞内质网中，是一个酶系统。可催化数百种药物的氧化过程。P450酶氧化药物的过程•复合：药物首先与氧化型细胞色素P450Fe3+结合成复合物。•还原：P450Fe3+-药物接受还原辅酶Ⅱ提供的电子，由辅酶Ⅱ细胞色素C还原酶传递，还原成P-450Fe2+药物。•接受一分子氧：P450Fe2+药物中

4、的低铁血红素能与分子氧结合。•再接受电子还原：O—P—Fe2+—药物再接受两个电子，由NADPH提供2或由还原辅酶Ⅰ供给，NADH-细胞色素b还原酶传递，激活分子氧成5两个离子氧。•氧化：一个离子氧使药物氧化，另一个与氢结合成水。同时，P450-Fe2+失去一个电子，而氧化再生成P450-Fe3+。因此可被反复利用用而起催化作用。药物与P450酶的关系•酶的底物（substrates）：由P450酶代谢•酶的抑制剂（inhibitors）：药酶活性减弱，使其他药物或本身代谢减慢,占代谢性相互作用的70%

5、•酶的诱导剂（inducers）：药酶活性增强，使其他药物或本身代谢加速，占代谢性相互作用的23%主要的P450酶•涉及药物代谢的CYP主要为CYP1、CYP2、CYP33个家族中7种重要的亚型：CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP2C19、CPY2D6、CYP2E1和CYP3A4常见P450抑制剂和诱导剂代谢稳定性评价•代谢稳定性考察的是化合物被代谢的难易程度和体外清除率的大小，常用体外代谢半衰期（T）和固有清除率（CL）表示。一般通过定1/2int量测定目标化合物在酶孵育体系中的清除情况

6、来计算。孵育系统•每个孵育体系总体积为200µL，体系包括0.1M的PBS缓冲液（pH=7.4）188µL，NADPH发生系统12µL。冰浴上将1～2µL的药物加入孵育体系中，在37℃水浴中预热5min；然后冰浴上加入5µL的肝微粒体酶，轻轻混匀，置于37℃水浴中孵育，在0min～60min设置5、6个时间点采集样品。待反应完毕之后加入400µL含内标的冰甲醇溶液终止反应。实验中加入孵育体系中的药物体积控制在1%以内，以防止溶解药物的有机溶剂对肝微粒体有灭活作用。结果计算•将孵育0min时间点待测化合物

7、的浓度作为100%，其他孵育时间点的浓度转换为百分剩余量，将各时间点的百分剩余量的自然对数对孵育时间作线性回归，求算得斜率k，根据公式，T=-0.693/k可以计算1/2得到体外半衰期。肝微粒体中的清除率（CL,mL·min−1·mg−1）=0.693/t(min)×孵育液(mL)/肝微粒体(mg)。1/2代谢表型•代谢表型指特定代谢酶对目标化合物代谢相对贡献的测算，以确定参与药物代谢的主要酶，为预测个体差异和药物-药物相互作用提供依据。理想的候选化合物的代谢转化是由多种酶介导，并且不是由一个高度多态性

8、的酶介导。代谢表型主要测定方法包括重组酶、选择性化学抑制剂、抗体抑制剂三种方法，其中选择性化学抑制剂法以其操作简单、成本低等优势被广泛应用。代谢表型实验和结果计算•本研究的目的是利用肝微粒体体外代谢孵育体系，通过底物消除法，测定加入不同选择性化学抑制剂后对药物的代谢消除的影响，考察在肝微粒体中参与代谢化合物的主要CYP450酶。•数据计算：用待测物的消除速率表示药物在微粒体孵育体系中的代谢速率；抑制率(%)=（1-加入抑制剂样品代谢速率/阳