肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义

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中山大学博七学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义专业：内科学(肾脏病学)研究生：李明导师：余学清教授中文摘要肾癌，又称肾细胞癌(renalcellcarcinoma,RCC)，其发病率占全身恶性肿瘤的3％，在病理上75％表现为透明细胞癌，不同病理类型的肾癌具有不同的临床特点、治疗方案和预后。血尿、疼痛、肿块称为肾癌的三联征。l临床上有30％一50％病例系偶然发现的无症状患者，而有症状者在诊断时大都已有或将发生转移病变。目前肾癌的主要治疗方法是外科手术根治，但既使早期患者手术治疗后，仍有部分患者将发生转移。转移性肾癌预后较差，对放化疗等治疗不敏感，3年平均存活率低于5％。因此，深入了解肾癌的发病机制，并在此基础上探索早期诊断和治疗方法有着重要的意义。目前肾癌的研究主要从蛋白组学、基因组学和microRNA(miRNA)组学等几方面来探讨肾癌的发病机制和寻找疾病早期诊断的分子标记物。其中miRNAs是近来才发现的一种小RNA，长度为22个核苷酸左右，可以结合靶基因的3’非翻译区(3’UTR)来降解靶基因的mRNA或者抑制蛋白质翻译。miRNAs作为转录后水平上的调控因子，在个体的生长发育和细胞的增殖、分化、凋亡等多种生物学过程中发挥重要作用。越来越多的证据表明miRNAs与肿瘤的发生有密切的关系，起着癌基因或抑癌基因的作用。机体内基因与miRNAs之间存在着相互作用，具体表现为一个miRNA可以有多个靶基因，而一个靶基因也可以调节多个miRNA，在一起交织成一个复杂的网络。已有的研究都是进行miRNA的表达谱分析，再进行靶基因的预测以了 中山大学博士学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义解它们之间的相互关系，这种方法不能全面地了解机体的基因调控网络。并且都是采用芯片的方法进行表达谱分析，而芯片具有假阳性高，不能检测低丰度表达的基因和miRNAs，不能鉴别新的miRNAs等缺陷，新一代测序技术因其高通量，高精确性可以弥补这一不足。为了全面系统地了解肾癌患者肾癌组织的miRNA表达差异及可能的临床意义，我们拟以肾透明细胞癌这一最多见的肾癌病理类型为研究对象，采用新一代测序技术Solexa平台，通过同时对miRNAs及基因的表达谱进行大规模比较基因组学研究，寻找肾癌中差异表达的miRNA和其相应的靶基因，从分子生物学水平上揭示miRNAs参与癌症的可能生物机理。并且运用比较基因组学和系统生物学的手段，了解miRNAs与靶基因作用的详细机制，为肾癌的诊断及治疗提供可靠翔实的分子生物学基础。我们共选取六名肾透明细胞癌患者，其中性别和年龄相匹配的男女患者各三名，分别对他们的肾癌组织和癌旁正常组织进行miRNA和基因的表达谱分析。我们的研究共检测到肾组织中有500多个miRNA的表达，其中200个miRNA的表达量较高。在所有肾癌患者的肾癌组织中约有64个miRNA的表达差异，其中下调表达的40个，上调表达的24个。我们将含有相同Seed(miRNA第2．8位)的miRNA聚类为同一家族，发现在男性患者中，18个miRNA家族在正常组织和癌组织中表达存在显著差异；在女性患者中，8个miRNA家族在正常组织和癌组织中表达存在显著差异。同时，我们还发现了100多个新的候选miRNA。在基因表达谱分析中，共检测到14000个基因，其中9400个基因的表达丰度较高。肾癌组织中以下调表达的基因为主。男女患者分别都有基因表达的差异；在所有患者中都有差异表达的基因共有28个，其中下调表达的基因26个，上调表达的基因2个。将这些基因进行功能分析，发现在下调表达的基因中有7个与代谢和信号通路相关，分别参与PPAR信号通路和脂肪酸和氨基酸等代谢途径。同时，我们采用系统生物学的方法将基因和miRNA表达谱进行综合分析。采用TargetScan运算方法，发现在下调表达的26个基因中有12个可能是潜在的miRNA的靶基因。鉴于miRNA是通过与靶基因的3’UTR结合来降解靶基因的mRNA，它们两者之间的表达呈反向关系，那么推测这些miRNA在肾癌组织 中山大学博士学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义中的表达应该升高。我们将在肾癌中上调表达的24个miRNA与它们进行比对，共发现有3个基因可能是上调表达的miRNA的靶基因。这3个基因分别是SLC4A4、CLCN5、GATM，而他们都是Iet．7的靶基因。我们对这6个患者采用实时荧光定量PCR(real-timePCR)的方法进行差异表达的miRNA和mRNA的验证，发现与测序结果相一致。随后又我们采用另一患者群(共26个患者)对差异表达的miRNA进行验证，并了解差异表达的miRNA与临床病理指标的相关性。发现在这26个患者中，肾癌组织和对应的癌旁组织差异表达的miRNA与测序结果基本一致，并且miR．142．3p与肾癌病理分级之间存在统计学差异。我们的研究首次采用新一代测序技术，应用系统生物学的方法进行肾癌患者肾癌组织的miRNA和基因表达谱研究，发现let-7在肾透明细胞癌中表达升高，其可能的靶基因是SLC4A4、CLCN5、GATM。并且发现了100多个新的候选miRNA。临床上miR一142．3p与肾癌病理分级之间可能具有相关性。提示肾癌患者肾癌组织miRNA的差异表达可能参与肾癌的发病。关键词：肾细胞癌，microRNA，基因，基因表达调控，系统生物学 中山大学博￡：学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义microRNAexpressionprofilinginrenalcellCarclnomaanditspotentialclinicalsignificanceABSTRACTRenalcellcarcinoma(RCC)accountsfor3％ofadultmalignanciesandisthesecondmostcommonurologicalcancerafterbladdercancer．Clearcellcarcinoma(ccc)isthelargestsubtypeofRCCandaccountsforapproximately75％ofthesetumors．DifferentpathologicaltypeofRCChasdifferentclinicalfeatures，treatmentandprognosis．About30％一50％patientshavenoclinicalfeaturesand30％RCCpatientshavemetastasiswhentheywerediagnosed．ThemaintreatmentofRCCisradicalnephrectomy，butevenafteroperation,somepatientsstillhavethemetastasis．ThemortalityrateofRCCismorethan40％．Therefore，earlydiagnosisandtreatmentisveryimportanttotheRCCpatients．CurrentstudiesofRCCmainlyfocusonthegeneandmicroRNA(miRNA)expression，touncoverthepathogenesisofRCCandfindthebiomarkerofearlydiagnosis．miRNAsareanabundantclassofsmallnon-codingRNAsofabout22nucleotidesinlength，whichfunctionasnegativeregulators(cleavageortranslationalrepression)ofgeneexpressionbybindingtocomplementarysequencesinthe3'-untranslatedregionsoftheirtargetmRNAs．RecentintensivestudieshaverevealedthatmiRNAsplayimportantrolesinalargenumberofbiologicalprocesses，includingcellulardifferentiation，proliferationanddeath．Inadditiontotheirphysiologicalfunctions，ithasrecentlybeenreportedthatmiRNAsareaberrantly—IV— 中山大学博士学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义expressedincertaincarcinomasandplayoncogenicortumor—suppressiverolesincarcinomaceils．GenesandmiRNAshavesomeinteractioninorganism，onemiRNAmayhavemanytargetgenes，whileonegenealsocanregulatemanymiRNAs，alloftheseconstructthecomplexnetworkoftheexpressionprofileoforganism．FormerstudiesmainlyfocusonthemiRNAexpressionprofiling，thenpredictthetargetgenes，whichmaynotcompletelyillustratethewholegeneregulationnetwork．ThemethodusedinthegeneandmiRNAsexpressionprofilestudyismainlymicroarraytechnology，whichhasseverallimitations，suchasbackgroundlevelsofhybridization，lackofdetectionoflow-expressedgenes，alternativesplicevariants，andnoveltranscriptsandmiRNAs．AllofthiswilllimittheaccuracyofexpressionmeasurementsandmaynotprovideareliablemeasureoftherelativeexpressionofdifferenttranscriptsandmiRNAs．Sequencing—basedapproachestomeasuringgeneandmiRNAsexpressionlevelshavethepotentialtoovercometheselimitations．NextgenerationsequencingtechniquesenablethousandsofmegabasesofDNAtobesequencedinamatterofdays．WechosetheIlluminasequencingplatformbecauseitscoverageanddeptharefargreaterthanothersequencingtechnologies，makingitparticularlyattractiveforexpressionstudies．Inthepresentstudy，weexplorethegeneandmiRNAsexpressionprofileinRCCbyusingtheSolexasequencingtechnology，toillustratethemechanismofmiRNAsandgenesinvolvedinthepathogenesisofRCCandfindthebiomarkerofearlydiagnosisinRCC．Simultaneously，wetrytousethecomparativegenomicsandsystemsbiologytofindoutthemechanismofthepossibleinteractionbetweenmiRNAsandgenes，givingthepotentialmolecularbiologicalevidenceforthediagnosisandtreatmentofRCC．TotalRNAswereextractedfromthemalignantandnon—malignanttissuesamplesof6RCCpatients(including3ageandsexmatchedmaleandfemale)，mRNAsandmiRNAswereisolatedandsequencedonthelllumilar(Solexa)IGSequencer．一V一 中山大学博士学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义Altogetherwedetectedtheexpressionofabout500miRNAgenes．Butabout300ofthemareverylowlyexpressedinsomepatients．Forthe200miRNAgenesthatalehighlyexpressed，I8families(miRNAsthathavesameseeds)aresignificantlydifferentlyexpressedinmalecancerandnormaltissues．And8miRNAfamiliesaresignificantlydifferentlyexpressedinfemalecancerandnormaltissues．Wenewlyidentifiedabout100miRNAsthatarenotreportedbeforeandtheirexpressionisgenerallylow．Weidentifiedtheexpressionofabout14000genesasannotatedbytheEnsembldatabaseinthegeneexpressionprofiling．About9400geneshaveRNA-Seqreadsgreaterthan10readspermillionreads(PMR)．Alargenumberofgenesweredown—regulatedinRCC．Inmale，expressionlevelsof215genesaresignificantlylowerinthetumorthaninthenormaltissuesand126geneshigherintumorthaninthenormaltissue．Infemales，383genesweresignificantlydown-regulatedintumorand195wereup—regulatedintumor．Therealetotally28genessignificantlydifferentinbothmaleandfemale．26ofthemweresignificantlydown—regulatedintumorswhileonly2areup—regulatedintumors．7outofthe26genesareknowninvolvedinthemetabolismpathways，includingPPARsignalingpathwayandfattyacidmetabolism．12outofthe26genesthataredown—regulatedinbothmaleandfemalesalepotentiallyregulatedbymiRNAsasidentifiedbythetargetScanalgorithm．Ifthe12genesdown—regulatedinthetumorsarecausedbymiRNAs，thenweshouldexpectsomemiRNAsareup—regulatedinthetumorsbecausemiRNArepresstargetgenes．BypoolingthemaleandfemalemiRNAdata,weidentified24miRNAfamiliesaresignificantlyup—regulatedintumors(P<0．05，pairedTtest)．3outofthe26genesaretargetedbytheup—regulatedmiRNAs，whichaleSLC4A4，CLCN5andGATM．ThemostsignificantmiRNAislet一7．Weusethereal—timePCRtovalidatethedifferentlyexpressedmiRNA，foundthatitisinaccordancewiththeresultofSolexasequence．Thenweuseanothersetof—VI— 中山大学博士学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义patients(26patients)tostudytherelationshipbetweenclinico—pathologicalfeaturesandmiRNA，foundthatmiR一142—3pmayberelatedtothepathologicalclassification，thedifferenceisstatisticallysignificant．OurworkisthefirsttostudytheinteractionbetweenmiRNAsandtheirtargetgenesusingthenextgenerationsequencingandsystemsbiologymethodsinRCC．Wefoundthatlet一7isup—regulatedinRCC，andSLC4A4，CLCN5andGATMmaybepotentialtargetgenesoflet-7．miR-142—3pmayberelatedtothepathologicalclassificationinRCC．AllofthesesuggestthatthedifferentialexpressionmiRNAsmaybepotentialbiomarkersintheearlydiagnosisofRCC．Keywords：renalcellcarcinoma(RCC)，microRNA(miRNA)，gene，geneexpressionregulation，systemsbiology—VII— 原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。彳学位论文作者签名：／辔硼日期：川车石月吕日学位论文使用授权声明本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。学位论文作者签冬夕细日期．牛咱8日导师签日期：垆厂月∥日 中山大学博士学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义专业：内科学(肾脏病学)研究生：李明导师：余学清教授．i上—JL刖置肾癌，又称肾细胞癌(renalcellcarcinoma，RCC)，是成人常见的泌尿系统恶性肿瘤之一，其发病率占全身恶性肿瘤的3％，占肾脏原发性恶性肿瘤的85％．90％【¨。全世界肾癌的发病率每年增加2％，每年死予肾癌者近100000例【21。在我国，肾癌发病率仅次于膀胱癌居泌尿系肿瘤第二位，相关的流行病学调查显示国内新发肾癌病例数呈逐年上升的趋势，是威胁人民健康的重要肿瘤之一。肾癌发病男女之比约为3．5：1，常于40岁以后发生，偶有30岁以下者。肾癌常起源于肾小管上皮细胞，近期研究表明，远曲小管和集合管也可能参与肾癌的发生。根据2004年WHO分类标准【¨】，肾癌在病理上可分为透明细胞癌(75％)、I型乳头状肾癌(5％)、II型乳头状肾癌(10％)、嫌色细胞癌(5％)和集合管癌(5％)，此外尚有l％左右的未分类肾细胞癌。不同病理类型的肾癌具有不同的临床特点、治疗方案和预后。肾细胞癌是一种泌尿系统独特的恶性肿瘤，临床表现及肾外表现极为丰富，临床病理学高度多样，很难做到早期诊断和治疗151。血尿、疼痛和腹部包块称为肾肿瘤的三联征。值得注意的是目前肾癌中有30—50％病例系偶然发现的无症状患者。三联征齐全时多已属晚期，且30％的肾癌在诊断时已有或将发生转移病变。肾癌的主要治疗方法是外科手术根治，但既使早期肾癌患者手术后，仍有30．40％将发生转移。转移性肾癌预后较差，对放化疗等治疗不敏感，平均生存时间仅3．33个月，3年存活率低于5％。 中山人学博。1：学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义由此可见，深入了解肾癌的发病机制，并在此基础上探索早期诊断和治疗方法对肾癌的预后及治疗方案的选择具有十分重要的意义。一．肾癌研究进展目前肾癌研究主要集中在：①寻找诊断早期肾癌的特异性生物标志物或相关抗原；②寻找指导肾癌药物治疗的指标；⑨探讨肾癌转移机制。其中，寻找肾癌早期疾病进展的生物标记，从而对疾病进行早期诊断，早期临床干预，是近年来研究的一个研究热点。目前的研究主要集中在肾癌的疾病相关蛋白和相关基因的寻找上，研究者们多采用蛋白组学和基因组学等研究方法，发现与肾癌发病和病程相关的蛋白和基因【6～。同时，近年来人们发现微小RNA(microRNA或miRNA)与肿瘤的发病密切相关，有些miRNA可以作为癌基因和相关的抑癌基因参与肿瘤的发生【引。目前已有肾癌miRNA表达谱研究的报道。以下简要介绍相关的研究进展。(一)蛋白组学研究在肾癌中的应用蛋白组学技术通过比较癌组织、正常组织及非癌性病变组织中的蛋白质群体表达模式的不同，来反映肿瘤的发生和发腱，为肿瘤的早期临床诊断和药效监测开辟了一条全新的路径(91。．近年来的研究主要是采用蛋白组学技术，比较肾细胞癌患者和正常人血清或肾组织中的蛋白组的表达差异，寻找特异的生物标记物。研究发现，在肾细胞癌患者血清中有碳酸酐酶和平滑肌蛋白22．0【两种特有的蛋白质的特异表达【9J：在肾癌组织中发现包括胸苷磷酸化酶(TP)等共6个候选基因的表达上调，提示它们有可能成为肾癌的特异性抗原标志物，并可尝试作为药物靶标【l引。同时，蛋白组学技术还可能作为观察免疫治疗疗效和预后的指标。研究者分析了应用和未应用丫．干扰素的肾癌细胞系和正常肾脏上皮中的热休克蛋白(HSP)家族成员表达谱，并观察了肾细胞癌患者血清中的抗HSP反应，发现HSP在肾细胞癌的免疫反应中起一定作用，可用来诱发免疫反应从而治疗肾细胞癌ll¨。综上所述，蛋白质组学为肿瘤研究提供了崭新的研究思路和技术支持。特别是在肾癌的早期诊断标志物、药效监测指标等方面己初见成效【12-13】。一2一 中山大学博十学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义(二)基因组学研究在肾癌中的应用基因组学为基因的功能研究绘制出基因的遗传信息“蓝图”，并且在核酸水平分析各种正常或异常生命现象与基因的关系。目前，人们利用基因组学技术开展了基因与各种疾病关系的研究，已取得了很大的成就。在肾癌的基因组学研究中，目前丰要采用基因芯片的方法进行肾癌基因表达谱研究【141。具体方法是对正常肾组织和肾癌组织进行基因表达谱研究，筛选得到差异表达的基因，并结合牛物信息学分析这些基因的功能。综合相关的文献报道，发现肾癌组织中上调表达的基因大多参与细胞粘附、信号转导、核酸新陈代谢等途径；而在肾癌组织中表达下调的基因主要分布在小分子运输、维持离子环境稳定、基本新陈代谢等牛物学途径【151。同时，基因芯片还可以研究不同预后的肾透明细胞癌的基因表达谱【161。研究显示，在绝大多数肾透明细胞癌中表达都发生变化的基因可以作为其病程和性质的分子标识。通过比较不同预后的肾透明细胞癌的基因表达谱，可以找到各种亚型的特征表达基因或者基因群，从而指导临床上的诊断、治疗，并对预后进行预测。鉴于肾癌还分为不同的组织病理亚型，研究发现，上皮细胞瘤各组织病理学亚型各自具有特征基因表达模式，这将有利于寻找各亚型新的分子标记和探索新的治疗方案【17】。目前还有很多报道发现在肿瘤中差异表达的基因可以作为肾癌早期诊断和分级的潜在生物学标志，为基因治疗提供相应的理论依据【18’20】。(三)miRNA组学研究在肾癌中的应用1．miRNA简介miRNA是近来发现的一类约有22个核苷酸(nt)的非编码的小RNA分子。这些小RNA分子在基因转录后水平上，通过与靶mRNA的3’非翻译区(3’UTR)完全或不完全的互补配对，促进目标mRNA降解或抑制蛋白翻译，对基因的表达起着负调节作用或基因沉默【211。研究显示，miRNA调控的基因至少占基因组的30％，作用涉及生长发育和细胞的增殖、分化、凋亡等多种生物学过程【22】。1)miRNA的牛物起源miRNA首先被RNA聚合酶II转录为较长的初始转录本，该转录本含有数千个一3一 中山大学博十学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义核苷酸，称其为p一一miRNA。在pfi-miRNA内，miRNA,／直于由大约70个核苷酸构成的环柄结构内。在动物体内，该环柄结构在细胞核内被RNA酶111Drosha和其辅助蛋I白Pasha／DGCR8识*Ⅱ和切割，形成p恪miRNA。之后，pre-miRNA迅速被RAN—GTP依赖的核质，细胞质转运蛋!；lExPortin5转运至细胞质，被位于细胞质内的RNA酶111DicerJ,*2--步切割，产生一个类似于小T扰RNA(siRNA)的miRNA：miRNA*92链体(miRNA*是miRNA的可补序列)。随后，该双链体解旋为成熟的miRNA和miRNA*，成熟的miRNA在RNA诱导沉默复合物(RNA—Inducedsilencingcomplex，RISC)；l导下与瓦{FmRNA完全或不完全配对，降解靶mRNA或阻遏其转录后翻译口"。≥箩／／=端～／摊：⋯。I忘，一竺毫茳F≮；≥一⋯l～⋯⋯⋯．=＼厂l⋯一E磊=]．⋯～⋯＼～，／图lmicroRNAs的生成。FigurelThebiogenesisofmicroRNAs2)miRNA的结构特点miRNA的结构特征卡要表现为：①广泛存在于真核牛物中．本身不具有开放阅读框(0RF)；②成熟的miRNA，5’端肯一个磷酸基团，37端为羟基，这也是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志：③miRNA最明显的特征就是具有一个发夹结构(hairpin)。手3：>bmiRNA具有高度的保守性、时序性和兰 中山大学博士学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义组织特异性【24l。31miRNA的作用机制一般认为miRNAs通常通过两种方式发挥作用：翻译抑制和靶标降解。这两种作用机制的主要差别之处在于miRNAs分子与靶分子mRNA的互补程度。一般miRNA不需要与靶mRNA的3’UTR完全结合，只需要7．8个核苷酸(又称seed序列)配对既可。完全互补或接近完全互补的情况存在于植物和少数真核生物中，在这种情况下，miRNA与靶RNA分子结合后可以将其降解，类似于siRNAs的作用方式。当miRNA分子与RNA的互补程度较低时，二者被细胞质处理小体(P．bodies)捕获，形成一种翻译抑制状态。由此可见，miRNA能够对基因表达进行细微调控，而P．bodies就像一个仓库，里面储存着未翻译的mRNA。迄今为止，人类共有706个miRNA被鉴定出来，一个miRNA分子可以跟多个靶mRNA(在人类中可达到数百个)结合，反过来，一个靶RNA分子也可以跟多个miRNAs分子结合，在～起形成复杂的调控网络1251。2．microRNA与肿瘤的关系目前随着对miRNA研究的深入，发现它们具有调节细胞增殖、分化和凋亡的功能，这些效应通过调控信号分子(如细胞因子、转录因子、生长因子、促凋亡和抗凋亡基因)的表达而实现。由于肿瘤本质上是一种多基因异常疾病，通过激活一种或多种原癌基因的表达及抑癌基因的突变缺失，使肿瘤细胞逃避了正常生长调控机制，自主进行增殖和侵袭，出现恶性表型。因此miRNA与恶性肿瘤的发生、发展和预后存在着密切的联系【261。尽管miRNA只代表了人类基因组的1％，但近30％的蛋白编码基因受其调节，广泛参与个体发育的各个环节。众多研究表明miRNA与肿瘤关系密切，然而miRNA是直接参与肿瘤生成还是仅仅作为肿瘤组织中一种有差异的受调节物还需进一步研究。另外，在不同的肿瘤组织中，同一种miRNA表达可以完全相反。研究表明全面抑制miRNA的成熟可促进细胞的转化和肿瘤发生。在肿瘤细胞中，miRNA成熟体或前体表达水平异常，并通过影响靶mRNA翻译发挥作用，在肿瘤形成中起重要作用。大量研究认为miRNA既可作为抑癌基因，下调原癌一5一 中山大学博士学位论文肾癌忠者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义基因的活性；也可作为癌基因下调抑癌基因的活性【271。多数miRNA定位在与肿瘤相关的染色体部位，miRNA的异常表达与特定肿瘤有关，可以调控重要的肿瘤相关基因，参与肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭或血管形成等过程。目前，已经发现miRNAs与肺癌、乳腺癌、B细胞慢性淋巴细胞白血病和肝细胞癌等癌症的发病密切相关，起着癌基因或抑癌基因的作用。其中一些miRNA，如miR一15／16，miR．17家族，miR．21，miR-155及let-7等己被证实与肿瘤相关【28】。miRNA的作用具有广泛性和复杂性。进一步阐明其对癌基因表达的调节作用及其机制，将有助于明确miRNA在肿瘤发生发展中的作用，进而揭示miRNA在肿瘤临床诊断和治疗方面的潜在应用价值f291。3．miRNA与肾癌的关系研究目前关于肾癌miRNA表达谱的研究已有三篇报道(见表1)，都是采用miRNA～芯片的方法，其中2007年美国的报道采用27个肾脏样本(包括20个癌组织，4个良性肾肿瘤组织和3个正常的肾组织)进行分析，发现仅有4个上调表达的miRNA(miR一28，miR—l85，miR．27和let．7f-2)，而没有下调表达的miRNA，并且发现肾癌的临床病理指标与miRNA的表达无相关性【30】。随后的一个日本研究小组的研究采用芯片的方法发现在肾透明细胞癌中以下调表达的miRNA为主，在43个表达差异的miRNA中，有37个明显下调，而只有6个是显著上调的。发现在所有病例中下调最明显的miR-141和一200C，其共同的靶基因ZFHXIB表达明显上调，而ZFHXlB基因又是CDHl／E-eadherin信号通路的抑制剂。随后的细胞实验证实了这一现象。因此他们推断，miR．141和．200c在肾癌中下调表达，进而通过上调表达其靶基因ZFHXIB而抑制了CDH1／E—cadherin的转录【311。2008年欧洲的一个研究，同样采用芯片的方法，在两个相对独立的病例群中进行研究，他们首先对12个患者的癌组织和相应的癌旁组织进行miRNA芯片分析，发现在癌组织中存在差异表达的miRNA，随后采用实时荧光定量PCR(real．timePCR)方法在同样的样本中进行验证。为确保结果的可靠性，他们又采用了另一包括72个患者的病例群，对其癌组织和相应癌旁组织进行real．timePCR一6一 中山大学博士学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义验证，发现共有13个上调表达，20个下调表达的miRNA。他们的研究也未发现miRNA和肾癌的临床病理指标之间存在关联性。但发现miR一141和miR-155的联合表达分析可以区分(准确率达97％)癌组织和正常组织【32】。表1．miRNA与肾癌的关系研究Table1．thestudyofmiRNAprofilinginrenalcellcarcinomasMonikaJung13个20个12肾癌不相关etal，2008Hsa-miR．16Hsa-miR．200b癌组织和对JournalofHsa-miR-452*Hsa-miR．363应癌旁组织CellularandHsa-miR．224Hsa-miR429(男7例)Mo跆cularHsa-miR-l55HswmiR-200c(女5例)MedicineHsa-miR．210Hsa．miR-514Hsa-miR．14lCNakadaai，2008JournalPathologyojAgilent芯片534探针(470人类)(64病毒miRNA)6个37个22样本未分析同上Hsa-miR-155Hsa-miR-1416正常组织Hsa-miR．224Hsa-miR．200Cl6癌组织Hsa-miR．122aHsa．miR．138Hsa—miR-452*Hsa-mil0514Hsa．miR．2l0Hsa．miR-4lHsa-miR．373*Hsa-miR．183Hsa-miR．381Hsa-miR-l84FedraHsa-miR．28一Gottardoeta1．Hsa-miR．185尢2007Hsa-miR．27UrologicHsa-let-7f-2Oncology：seminarsandoriginalInvestgations27样本不相关20癌组织4良性肿瘤3正常组织368探针(共248miRNA)(161人类)(84鼠)(3拟南芥)这三个研究都是采用基因芯片的方法，而得到的结果不尽相同，尤其是2007年的研究，仅找到上调表达的miRNA，而随后的两个研究发现以下调表达的miRNA为主。究其原因可能为：①目前发现的人类miRNA已有706个，而之前研究所用的芯片分别包括245个和470个miRNA，资料不全面可靠，限制了一7一 巾山大学博．}：学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义研究结果的全面性。②基因芯片本身具有通量高，可测动力学范围较宽，但是很难区分前体miRNA和成熟的miRNA，并且对低丰度表达的miRNA的分辨率较差。同时基因芯片不能检测一些未知的miRNA。由此可见，目前采用基因芯片方法受到一定的局限性，而新一代测序技术(next-generationsequencing)的出现对解决上述不足提供了可能。二．新一代测序技术(一)新一代测序技术简介新一代测序(nextgenerationsequencing，NGS)技术的产生使基因组学和功能基因组学进入了一个低成本、大规模、高通量测序的时代。其核心是采用边合成(或连接)边测序的方法。即生成新DNA互补链时，加入的dNTP通过酶促级联反应催化底物激发出荧光，或者直接加入被荧光标记的dNTP或半简并引物，在合成或连接生成互补链时，释放出荧光信号。通过捕获光信号并转化为一个测序峰值，获得互补链序列信息。目前丰要包括Roche(454)，Illumina(Solexa)黍lAppliedBiosystemsSOLID三种测序平台‘33剐】。三种平台之问的比较总结如下表：表2新一代测序技术的性能参数比较Table2Comparingmetricandperformanceofnextgenerationsequencer其中Illumina(solexa)测序平台以数据读取量大，精确度较高，测序覆盖范围和深度广，价格低廉而应用较为广泛。其测序原理是“边合成边测序’’，同时可以在DNA扩增表面读取数千万个32-40bp长的片段。Solexa测序流程如图所示：①添加接头：利用物理方法将待测样品DNA打碎，在DNA碎片两端加上接头。②表面结合：Solexa测序时利用微注射系统将已经加过接头的待一8一 中山大学博_l=学位论文肾癌患者肾癌组织mlcroPⅢA差异表选发可能的临睐意义测片断添加到测序通道上，井以共价键的形式与测序通道上的接头引物随机结台，固定单链接头序列和带接头的单链待测DNA片断。@桥型扩增获得多拷贝待测DNA片断：在测序通道内加入未被标记的dNTP和普通Taq酶进行固相桥型扩增。所有的单链桥型待测片断被扩增成为双链桥片断，通过变性．释放出瓦补的单链，锚定到附近的固相表面。通过不断循环，将在测序通道的固相表面上获得上百万条成簇分布的双链待测片断。④测序：加入DNA聚合酶和4种被荧光标记的dNTF和接头引物进行扩增，在每个测序簇延伸：巧：补链时，每加入一个被荧光标记的dm就能释放出相对应的荧光，涮序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。一般地，测序一个反应获得的数据量在400～500Mb范围内．运行一个反应需要4天时阃。但是，由于序列读长较短，击除接头序列后，有效读长更短．因此测序后数据的装配需要有强大的生物信息学分析能力作为支撑ml。r一一I；_17佃、'。_．’：。㈠严。h，4、㈠川”则』⋯搴。-￡=o’，一，1r、≯。善。i警、。。．掣‘_6··■．掣。√_0，一●№t2意≮附图2llluminaOenomeAnalyzer(Solexa)测序流程Figure2lllumina$enomeanalyzer(soh舢workflow铀一o，AP三”一 中山大学博十学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义(二)新一代测序技术的应用新一代测序技术及其商业化平台推出后，其相对低廉的价格、高通量的数据和简易的样品前处理过程，将基因组学水平的研究带入了一个新的时期，也使我们对基因组学研究的认识和思考上升到一个新的水平。从2005年至今，利用新一代测序技术，已经在国际项级学术期刊上发表了数百篇高水平论文，涉及多学科领域。目前其应用主要包括：①Denovo测序与重测序：测定整个基因组的序列或基因组上以个大片段候选区域的序列[37-401。②转录组和表达谱分析：对mRNA分子进行序列测定，对整个转录组或特定的组织和器官进行数字化分析【411。③Chip．Seq分析：为获得全基因组范围内DNA甲基化、组蛋白各种修饰、转录因子等的高分辨率分布图，对染色质免疫共沉淀(CHIP)获得的DNA片段进行大规模测序，并把所关注的蛋白的DNA结合位点精确定位‘421。④小RNA鉴定与定量分析：发掘、鉴定并定量检测出任何物种全基因组水平的miRNA图谱【431。可以预见，采用新一代测序技术进行基因组测序或重测序以及基因组及小RNA水平的数据分析研究将使分子生物学研究进入了一个崭新的时代。本研究首先对我院2007—2009年的肾癌患者进行回顾性分析，了解肾癌流行病学的基本情况。接着采用新一代测序技术Solexa进行肾癌患者肾癌组织miRNA和基因表达谱的研究，以期寻找到肾癌组织中特异表达的miRNA及其靶基因，揭示差异表达的miRNA与临床病理之间的相关性，为肾癌的早期诊断和判断预后提供科学依据和奠定实验基础。一lO— 中山大学博士学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义第一章肾癌流行病学基本情况肾癌的发病率和死亡率在全身恶性肿瘤中约占3％左右，位居泌尿系统恶性肿瘤发病的第二位，有20％一30％的患者首次就诊时就存在转移，30％术后发生转移【州。研究显示，近年来国内新发肾癌病例数呈逐年上升的趋势。而了解目前肾癌流行病学的特点，将为我们进行肾癌的临床和基础科学研究提供详实的理论基础。本章的研究目的是，收集2007．2009年收治的肾癌患者120例，对临床表现、病理类型、治疗方法等进行回顾性分析，以了解肾癌流行病学的基本情况。材料与方法一．研究对象：收集2007年3月一2009年3月中山大学附属第一医院泌尿外科收治的且术后病理证实为肾癌的完整病例资料120例，查阅病案记录资料收集包括性别、年龄、症状、吸烟史、高血压史、病理类型、实验室检查及治疗措施等临床情况。二．临床及病理资料观察与判断标准：病理类型按照2004年国际抗癌联盟(UICC)和美国癌症联合会(AJCC)制定的肾癌病理学分型法；病理分级采用2004年WHO分类标准【3】：I临床分期标准按照2002年美国癌症联合会(AJCC)的TNM分期系统进行分期。肿瘤的直径以病理报告和影像学报告肿瘤的最大径为标准。按WHO／ISH建议的收缩压>18．6KPa(140mmHg)和／或舒张压>12Kpa(90mmHg)为成人高血压的诊断标准。吸烟判定标准：有吸烟史1年以上且平均每日≥20支。三．统计学分析：全部资料经SPSS13．0统计软件处理。计数资料用频数和百分比表示；两组资料均数比较用t检验；多组资料均数比较用方差分析；计数资料比较用Z检验，以P<0．05作为有统计学意义的标准，P<0．Ol为有极显著差异。 中山大学博士学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义硅里；口木一．患者基本情况共有120例患者，其中男性78例(65％)，女性42例(35％)。年龄25．78岁，平均年龄55．4岁。病变位于左侧57例(47．5％)，右倾,1J63例(52．5％)。病程为l天到5年，其中病程<3个月者102例(85％)，4．12个月者12例(65％)，>12个月者6例(65％)。按照美国抗癌协会TNM分期法，本组120例患者中，，TlNoMo期74例(61．6％)，T2NoMo期38例(31．6％)，T3期以上8例(6．8％)。18例患者有体重下降(15％)。有吸烟史者35例(29％)。高血压病史者43例(36％)。患者的一般资料见表1．1。表1-1患者的一般资料TabIe1．1．PatlentCharacteristics—12一 中山大学博十学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义二．临床表现：82例(68．3％)患者无任何临床症状，经体检或因其他部位不适在检查中偶然发现。无症状者通过B超发现的有70例，占86％。有症状肾癌患者共38例(31．7％)，患者以无痛性血尿居多，占22例，其次为腰背部不适、疼痛12例，腰部肿块4例。肾外表现中，红细胞沉降率升高占35％(2l／52)。其中偶发肾癌与有症状肾癌的比较见表1．2。表l-2偶发肾癌与有症状肾癌比较Table1-2ComparisonbetweenasymptomaticandsymptomaticRCCpatients三．影像学检查：120例均行彩色多普勒超声检查，提示肾癌llO例(91．6％)，肾囊肿8例(6．7％)，其他病变2例(8．3％)。CT检查120例肿瘤表现为低密度影87例(72．5％)，等密度影26例(1．6％)，高密度影7例。112例静脉注入造影剂后肿瘤有不同程度的强化表现，但均低于正常肾实质。在无明显强化的5例中，4例误诊为肾囊肿，l例误诊为肾盂癌。30例行MRJ检查，全部诊断为肾癌。四．病理类型：本组患者中118例行手术治疗。病理检查诊断为透明细胞癌105例，颗粒细胞癌10例，混合型(透明加颗粒)细胞癌3例。肿瘤分级GI3l例，G262例，G39例，G46例，另有10例分级不清。五．治疗方法：106例患者行根治性肾切除术，其中经腹腔镜治疗22例，经腰ll肋入路行开放式手术的84例。共有5例同时行淋巴结清扫术及同侧肾上腺切除。12例行保留肾单位肾癌切除术(肿瘤直径<3．0cm10例，肿瘤直径≥3．0cm2例)。另有两例患者因转移肾癌未做任何治疗。一13一 中山大学博上学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义讨论从我们进行的回顾性分析结果可以看出，肾细胞癌发病男女之比约为1．8：l，发病年龄以40岁以上者居多。其发病率逐年提高，国外和国内的报道均提示每年以2％-4％的速度增长，究其原因，考虑为检出率的提高。同时，无症状偶发肾癌的患者数增多。我院泌尿外科曾经统计1993---2000年收治的271例肾癌患者，其中偶发肾癌82例，占总数的30．3％【451。本研究发现偶发肾癌患者占其总数的68％，原因主要是B超的广泛普及和CT的升级换代，极大地促进了肾癌的早期诊断，使早期的手术治疗成为可能，提高了肾癌患者的生存率。在临床表现方面，血尿、腰痛和腰部肿块三联征齐全的患者非常少见，血尿仍是肾癌最重要的临床表现。肾外表现中以红细胞沉降率加快最为多见，提示如果患者持续性红细胞沉降率加快，又排除了发热等其他因素，应常规进行肾脏检查以排除肾癌的可能。在诊断方面，由于肾癌早期病灶小，IVP及逆行肾盂造影常常不能显示肾盂肾盏受压和变形等改变，故诊断阳性率低。B超检查简便易行，无创伤性，敏感性高，可作为肾癌的首选检查和普查筛选方法。CT扫描加强化对早期肾癌的诊断准确性高于B超，可显示0．5～lem的肿瘤，平扫时，大多数肾癌呈不均质的低密度改变，强化扫描时绝大多数肿瘤有不同程度的强化表现，但均低于肾实质强化。同时CT对肿瘤的分期及对肾静脉和下腔静脉癌栓的诊断准确率高达90％。MRI在显示肾静脉或下腔静脉受累、周围器官侵犯及肿瘤出血、坏死、囊变等方面优于CT。MRI的三维影像重建对于肾癌的诊断和术前评估具有重要指导价值。IVP和逆行肾盂造影诊断准确率较低。选择性肾动脉造影可以清楚地显示肾肿瘤的血管状况，但属于有创伤性检查，非首选检查手段。肾癌最有效的治疗方法是早期进行根治性肾切除术146】。近年来，现代医学影像技术的发展及人们健康体检意识的增强，使早期肾癌的发现明显增多，为保留肾单位手术的开展提供了很多机会【47郴l。肾肿瘤剜除术、肾部分切除术的开展明显增多，并且经临床证实安全有效。目前普遍认为，对于肾下极直径<3Gill的小肾癌，可行保留肾单位的肾部分切除术。本研究的统计资料表明共有12名患者行肾部分切除术，术后随诊患者一般情况较好。对于肾根治性手术，目前可采用开放——14—— 中山大学博士学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义式和腹腔镜手术两种，本研究中行经腹腔镜手术的患者22例。目前普遍认为，相对于开放式手术，腹腔镜肾切除病人术后疼痛轻，恢复快，疤痕小，如果把所有费用考虑在内，比传统手术花费少。因此，目前的观点提倡进行腹腔镜肾癌根治术。在肾癌的病理学研究方面，本研究发现最多见的是肾透明细胞癌，为105例患者，占88％。其次为嫌色细胞癌和乳头状细胞癌。在病理与临床预后的关系上，有报道不同病理学类型的肾癌患者预后无显著性差异1491，也有部分认为嫌色细胞癌预后明显好于乳头状和透明细胞癌，肉瘤样肾癌预后最差f50】。目前普遍认为，Fuhrman分级可作为判断顸后的因素，但独立预后分析价值尚存异议【51。521。对核仁及其大小的评价结果常与病理医师的主观因素有关，为了克服核分级系统带有主观偏面性，国际抗癌协会建议应结合其他客观指标，例如增殖细胞抗原标记物、肿瘤分期、核仁形态学特征、核分裂象等多方面进行综合分析。总之，我们的研究发现，随着影像学技术和人们健康意识的提高，越来越多的无症状的早期肾细胞癌得到诊断和及时治疗，大大提高了生存率。同时在肾癌的诊断和治疗水平上也有明显的提高。但是，我们也看到即使早期无症状的患者，其术后生存率也不是很理想。因此，如何寻找肾癌早期诊断的有效的生物标记物，从而可以更早期地诊断，早期治疗，成为困扰临床科研工作者的一个难题。随着微小RNA(miRNA)的发现，许多研究提示miRNA与肿瘤的关系密切，目前在肺癌、乳腺癌及结肠癌等肿瘤中均发现潜在的早期诊断的生物标记物。而肾癌相关的研究还很少。我们拟以肾透明细胞癌为研究对象，全面了解miRNA与肾癌的相关性，寻找差异表达的miRNA及其靶基因，并探索其可能的临床意义。一15一 巾山大学博士学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义第二章肾癌患者肾癌组织miRNA表达谱分析近年来的研究发现，mil州A与肿瘤的关系密切，其中在肺癌、乳腺癌和白血病等疾病中都发现有差异表达的miRNA，其中有些miRNA可以作为癌基因或抑癌基因在肿瘤的发病中起重要作用。但是目前在发病率为十大肿瘤之一的肾癌中，相关研究尚不多见。本部分研究目的主要是采用Solexa测序技术分析肾癌患者肾癌组织的miRNA表达谱，以进一步探讨miRNA在肾癌发生发展中的调控作用。一．实验材料材料和方法1．研究对象选取中山大学附属第一医院泌尿外科2008年9月"--'2008年12月收治的肾透明细胞癌患者共6例，其中男3例，女3例；年龄25"--74岁，标本常规做光镜、电镜检查。肿瘤分级和分期标准按照2002TNM系统和2004WHO分级系统的标准。所有病理结果均经两个以上的病理医生核实。所有患者均签署知情同意书，获中山大学伦理委员会同意。2．主要试剂mirVanaTMmiRNAIsolationKit(Ambion公司，USA)SmallRNASamplePrepKit(1llumilar公司，USA)无水乙醇(广州化学制剂总厂)琼脂糖(上海博采生物有限公司)溴化乙锭(10mg／mL)(1nvitrigen公司，USA)lOx甲醛变性电泳缓冲液37％甲醛溶液(12．3M)一16一 中山大学博士学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义定量PCR用酶SYBRGreenPCRMasterMix(TOYOBO公司，日本)3．实验仪器“测序设备：Illumina(Solexa)1GSequencer(1llumina公司，USA)电泳设备；Bio—PadMini—SubGTSystem(Bio—Pad公司，USA)凝胶成像仪：UVPGDS7600凝胶图像成像与分析系统(PE公司)紫外分光光度计：NanoDropND一1000Spectrophotometer(NanoDrop，USA)台式微型离心机：EppendorfMicrocentrifuge(Eppendorf公司，Germany)冷冻桌面离心机：Eppendorf581ORCentrifuge(Eppendorf公司，Germany)超低温冰箱：Formascientific(USA)恒温水浴箱：HelserUP200S(Germany)定量PCR仪：ABIPRISM固7300SequenceDetectionSystem(ABI公司，USA)二．实验方法1．样品采集及储存：肾癌组织及其癌旁组织(规定距癌组织5cm以上)取自中山大学附属第一医院泌尿外科行肾脏全切术后的标本。癌肿切除离体后立即置入冰盒送检，肉眼状态下切取癌及癌旁组织各约500mg标本，尽量避免含有坏死及纤维结缔组织，去离子水反复冲洗三次以去除多余红细胞，随后迅速放入液氮中冻存。从肾脏离体到标本采集完毕要在30min内完成，以尽量减少RNA降解的风险。分别对癌组织和癌旁组织做石蜡切片，HE染色观察组织形态变化。2．冻存的肾脏组织标本总RNA的提取：1)抽提RNA前，先把研钵预冷，往研钵内反复加入液氮，至少4．5次，使研钵充分预冷。2)从液氮罐取出样本后，把组织块放入己预冷的研钵中进行研磨，边研磨边加液氮，整个过程都不要使液氮挥干。一次研磨的组织块重量不要超过300mg。3)研磨到组织样品成粉末状后(一般需要8．1O分钟的研磨过程)，在液氮基本挥发时，在每个研钵中加lO倍体积于组织质量的lysis／bindingbuffer(如每O．1g的组织加入lml的lysis／bindingbuffer)，并充分研磨。一17一 中山大学博士学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异袁逃及可能的临床意义4)把此buffer试剂转移到玻璃匀浆器中，再进一步匀浆3-5分钟。5)将buffer试剂转移到l5ml离心管中，加入1／10裂解液体积的microRNAHomogenateAdditive，混匀t冰上放置10rain；6)加入与裂解液等体积的酚：氯仿溶液，混匀，最大速度(10，00009)，室温离心5min；7)小心地将上清液移到干净的管子中，并记一F液体的体积；8)加入125倍上清液体积的无水乙醇(室温)，彻底混匀；9)将裂解i菠，酒精的混合物加入到FilterCartridge柱子中，在RCF为10，00009F离心约15s，弃掉滤液，重复利用收集管(每次柱子容量为700itl)：10)加入700“lmicroRNAWashSolutionI，10，000rpm离心5-10s，弃掉滤液，重复利用收集管；lI)加入500ILlWashSolution2，3，10．000rpm下离心5-10s，弃掉滤液；重复洗涤一次；12)10．000“g空离心Imin，以备去除滤膜中残余的液体；13)将FilterCartridge柱子移到干净的管子中，加入100pl预热到95℃的Nucle,Ⅲse—freeWater到滤膜中间，最大速度离心20-30s；重复上述步骤一次，合并两次的收集液。14)收集的样品用于后续实验或保存于-80℃。图2-1mirVanaTMmiRNA分离试剂盒的步骤概述 中山大学博士学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义3．总RNA纯度和浓度的检测使用NanoDropND．1000分光光度计测定RNA浓度和纯度，测量前先用溶解RNA用的DEPC水调零，操作方法如下：1)滴加l¨lDEPC水或者RNA样品至测量基座的表面；2)液滴自动在上下基座之间形成液柱并自动完成测定，RNA浓度及质量的各种参数将在电脑中自动生成文件；3)一次测定完成后，用柔软的擦镜纸擦去上下基座表面上的样本液，便可进行下一个样品的测量；4)测定结果(电脑自动牛成的EXCEL和JPEG文件报告)：样品RNA浓度计算公式为：A260×40n94tlRNA纯度检测：RNA溶液的A260／A280的比值是一种RNA纯度检测方法，比值范围1．8到2．1。4．总RNA质量的鉴定采用变性琼脂糖凝胶电泳的方法进行检测。制备1．2％琼脂糖凝胶(电泳槽体积为50m1)1)凝胶制备：①称取O．69琼脂糖，加入43．5ml水，加热溶解并降温到60*(2。②加入5ml10x甲醛变性电泳缓冲液，并加入1．5ml37％的甲醛，混合均匀。③倒入电泳槽中制胶(甲醛有毒，制胶应在通风橱中进行)。2)RNA模板准备(5-7．5pgtotalRNA)①制备如下混合液(9．791)10x甲醛变性电泳缓冲液：1．251．tl37％的甲醛：2．21al甲酰胺：6．251al②加入2．81ttlRNA，使总体积达到12．5“l③混合后离心5～lO秒(1000～2000r／min)④55℃加热15min⑤加入2．5I，tl甲醛凝胶加样缓冲液，再加EB(约O．2~o．591)，混合后离心5秒3)电泳一19— 中山大学博：I二学位论文肾癌患者肾癌组织mieroRNA差异表达及可能的临床意义将样品加入点样孔，在5v／cm的电压下电泳至溴酚蓝带跑到电泳槽中央(20em长电泳槽，用95v电压，l小时左右)4)紫外透射光下观察并拍照：质量较好的RNA电泳后的条带应该是：28S和18S核糖体RNA的带亮而浓，还可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带。RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。5．miRNA的制备制备的过程包括：①将总RNA跑TBU变性胶，回收16—30nt的小RNA；②5’adaptor连接并纯化回收连接产物；③3’adaptor连接并纯化回收连接产物；@RT--PCR并回收一-92bp大小的条带。步骤详述如下：1)回收16--一30m的小RNA①将总RNA跑TBU变性胶(15％TBE．ureagel)，在UV紫外照射仪上切胶，切下范围大小约为16nt-～30nt胶块。将切下的胶条放入己扎孔的离心管内。②回收小RNA：a)离心和洗脱：14000rpm离心2分钟，向含有碎胶的离心管内加入300山～500txl的0．3MNaCI，置于混匀器上温和洗脱4个小时。b)沉淀回收：将2ml管内的胶块和洗脱液全部转移至Spin—X管内，离心2分钟，弃碎胶。加入3lxl糖原，9009l100％乙醇，混匀后于一80℃冻存l小时。80％乙醇洗沉淀，离心5分钟，吸弃上清，晾干。c)加入6．5～9．51xlDEPC水溶解RNA。2)5’adaptor连接并纯化回收连接产物；①5’adaptor连接连接体系：一20— 中山人学博士学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义RNA5’adaptor(25pM)T4RNAligationbuffer(10x)RnaseOUT(40U／1．d)5．7m1．3pl1．0p,l1．oWT4RNAligase(10U／p1)1．Olttl总体积为101xl，混匀离心，于20*(2连接6个小时(或16"(2过夜)。②纯化回收5端adaptor连接产物：a)向连接产物中加入10pl2xgelloadingdye，65"(2变性5分钟。200V预跑15％TBU15"-'30分钟，上样前彻底冲洗胶孔。b)将20p,l样品混合物分两个孔上样，200V电泳约50～55分钟，1XTBE／EtBr染胶2--．3分钟。切下40．60nt胶块。转至O．5ml离心管中，14000rpm离心2分钟。c)加入3001xl0．3MNaCI，室温旋转混合4小时。转移碎胶及洗脱液至Spin—XFilter离心2分钟。加入750pl无水乙醇，3p,lglycogen，混匀后--80℃放置l小时。弃上清，用80％乙醇洗一遍，晾干，溶于6．4mDEPC水中。3)3’adaptor连接并纯化回收连接产物①3’端adaptor连接连接体系：5’端连接产物3’RNAadaptor10xligationbufferT4RNAligase(10U／1吨I)6．4B10．6pilpl11．tlRnaseOUT(40u／p1)lpl总体积为lO肛l，混匀后离心，20℃连接6个小时然后4℃保存。②纯化回收3’端adaptor连接产物a)10％TBU200V预电泳10—30分钟，用缓冲液IxTBE彻底冲洗胶孔。向一2l一 中山大学博l：学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义连接反应混合物中加入等体积2xloadingdye终止反应，65"C变性5分钟，离心，置冰上。b)将样品加入两个加样孔(约每孔10ffl)，200V电泳约50分钟。IxTBE／EtBr染胶2．3分钟。c)参考lObpladdermarker切下70—90nt条带。将切下的胶块置于离心管中，离心2分钟。加入300lxl0．3MNaCI，室温旋转4小时洗脱。d)转移碎胶至Spin--Xfilter,全速离心2分钟。加入750“l的100％酒精，31xl糖原，混匀，一80。C冷冻l小时。e)14000rpm／30mins／4。C离心，弃上清，再用750“1室温的75％乙醇洗1次，晾干后加入6．41xlDEPC水溶解RNA。4)RT--PCR并回收一--92bp大小的条带①RT-PCRa)反转录反应体系和条件：RNA(已纯化的加有5’和3’接头的RNA)4．5ulRT-Primer(100uM)0．51xl65*C]JN热10min，离心冷至室温依次加入：5xfirststrandbuffer12．5mMdNTP100mMDTTRnaseOUT(40U／txl)2．Olxl0．5txl1．01．tl0．5m混匀后离心于48℃放置3分钟。再加入llxlSuperscriptII(200U／lxl)，混匀后瞬时离心，44*(2反应1个小时。70"C变性15分钟。b)PCR反应体系和条件：一22— q，山大学博上学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义反应体系：RT--reactionmixH2025mMdNTP5XPhusion*HFbufferPrimerGXIPrimerGX2Phusion宰DNAPolymerase101al281xl0．5肛l10¨l0．59l0．51xl0．5p,I反应条件：Total②PCR产物回收纯化501xl98℃／30sec：984C／10see，60*(2／30see，72*(2／15see；15cycles；72℃／10min；4℃hold。a)取6％TBEPAGE胶，将501al的PCR产物中混合109l6Xloadingdye，分2个加样孔上样；200V电泳约30分钟。切下约92bp的条带。b)在碎胶中加入100lxl1Xgelelutionbuffer，室温下混匀2小时，洗脱DNA。将碎胶和缓冲液转入Spin--Xfilter，离心2分钟。C)向洗脱液中加入lptlglycogen，10tll3MNaAC，325Ixl100％_20。C乙醇。混匀后4。C离心20分钟。离心后弃上清，加入5001xl70％乙醇洗涤沉淀，晾干，用10lxlEBsolution溶解沉淀。⑨小RNA已制备产物经RNA质量检测一般15个循环的PCR产物的检测浓度约在10ng一100ng／lal之间。片段大小在100bp左右。6．将纯化的eDNA稀释至10nM后，直接在llluminaIG(Solexa)Sequencer上机一23— 中山大学博：l：学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA筹异表达及可能的临床意义操作。7．小RNA数据的计算机分析1)从Solexa测序产生的原始数据中得到全长的小RNA序列。步骤包括：①除去低质量的序列；②去除3’接头序列；③去除接头污染；④收集小RNA(18．30nt)并绘制大小分布及计算每条序列的测序频数；2)将小RNA序列定位到基因组上，探索其在染色体上的分布特征；采用SOAP软件(http：／／soap．genomics．org．cn)将小RNA序列定位到参考序列中。3)将小RNA注释和分类到不同的类别将小RNA分类：①已知的miRNAs：采用miRBase的数据进行分析(http：／／miRNA．sangeeac．uk／sequences／ftp．shtml)；(至)rRNAs，tRNAs，snRNAs和snoRNAs的降解片段：通过与Rfam数据库以及其他一些已知的非编码序列比对；③重复相关的小RNAs。4)预测新的候选miRNAs．根据本研究获得的小RNA测序结果，利用LuJianeta1．2008(NatureGenetics)【53】的分析流程来预测新的miRNAs．8．实时荧光定量PCR：PCR反应流程见图2-2。．一●。--。R砖verselatimer图2-2miRNAs实时荧光定量PCR示意图(包括茎环法逆转录和实时定量PCR)Figure2-2Schematicdescriptionofreal-timequantificationofmiRNAs(includingtwosteps，stem-loopI玎andreal-timePCR)一24— 中山大学博士学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义1)将RNA逆转录为cDNA：使用茎环法，引物序列见表2一l。表2-1逆转录引物序列：Table2-1reversetranscriptaseprimersequencesmiRNA逆转录引物hsa-miR．142-3PCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAAn℃AGTrGAGTCCATAAAhsa-miR一24CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCA久n℃AGTrGAGCTGTrCCThsa-miR．200cCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAAGAGTCGGCAA丌℃AGl’rGAGTCCAT℃AThsa-miR．155CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAArTCAGTrGAGACCCCljAThsa-let-7aCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAAGAGTCGGCA芦dTCAGTTGA6一■C?Z7彳CAAC内参(U6)AACoCTTCACGA筒nT(ⅪGT①取总RNAllag，置于一干净PCR管中，加无RNA酶水至总体积10“l②将上述溶液混匀，72℃孵育5min，以打开RNA二级结构。随后立即置于冰上，以防止RNA复性再次恢复二级结构；③在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液let7a逆转录引物O．5¨lmir24逆转录引物0．5“lmirl42—3p逆转录引物0．5“lmirl55逆转录引物0．5“lmir200c逆转录引物0．5rtlU6逆转录引物2．O“ll0raMdNTP(promega)0．5pIRNaseinhibitor(promega)4．0lal5xbuffer0．5plM-MLV(promega)0．5pl总体积lO弘l④将③溶液加入到①溶液中，混匀后30*(2孵育10min⑤42℃孵育50min；⑥72℃孵育10min灭活逆转录酶。一25— 中山大学博：I：学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA筹异表达及可能的临床意义2)实时定量PCR①实时定量PCR引物序列：见表2．2表2-2实时定量PCR引物序列：Table2-2real-timePCRprimersequences②反应体系：③反应条件：eDNA(1：25)5．0上游引物(109M)0．5下游引物(109M)0．52xSYBRGreenPCRMasterMixl0H208pl总体积95℃10min．上95℃15s，√哪t＼2065℃15s．一-．72℃30s读板；熔解曲线分析：温度60*(2—95℃，每分钟读1次。每个样品重复3次。一26— 巾山人学博士学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义④数据分析：数据采用2△△CT法进行分析。以癌旁正常肾组织样品为参照进行计算9．相关统计分析1)采用pearson’Scorrelationcoefficient(R)进行两个变量之间的相互关系分析。2)所有标本均重复检测两次取均值，计量资料用X：L-s表示，多组资料比较用方差分析，两组之间比较采用两样本均数t检验。P值<0．05为有统计学意义。一27— 中山大学博士学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义一．肾癌患者的基本临床资料乡士里耋口术共选取病理为肾透明细胞癌的患者6名，其中男女性患者各3名。收集相应的临床治疗，包括患者的年龄、性别，肿瘤分级以及TNM分期。每个患者都留取了癌组织和相应的癌旁组织。其中TNM分期标准为：肿瘤(T)：To无原发性肿瘤的证据；Tl肿瘤小，患肾形态不变，局限于肾包膜内；T2肿瘤大，患肾变形，但肿瘤仍局限于肾包膜内；T3肿瘤侵及肾周脂肪或静脉；T4肿瘤已侵入邻近器官。淋巴结(N)：Nx淋巴结有无转移不肯定；NO淋巴结无转移；N1同侧单个淋巴结受侵；N2多个区域淋巴结受侵。远程转移(M)：M0无远处转移的证据；M1有远处转移。具体患者的临床资料见表2．3。表2．3肾透明细胞癌患者的临床病理特征Table2—3theclinical·pathologicalfeaturesofclearrenalcellcarcinomaspatients二．RNA的纯度与浓度检测1．由肾脏组织提取的总RNA，通过1．2％变性甲醛琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度仪检测RNA的纯度和浓度，所有RNA标本均显示18S、28S两条带，证实抽取的总RNA具有完整性(图2．3)。经NanoDropND一1000分光光度计检测，一28— 中山大学博十学位论文肾癌忠者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义A260／A280比值均在1．8-22之间。经计算，RNA样术的浓度为0．4·07ugM图2-3总RNA电冰图Figure2-3GeleleclrophowsischeckoftotalRNAineachgroup(1．2．F6为患者的肾瓣lI}织佯小编号)三．小雕^测序分析结果：l小RNA测序产牛的总读数分析小RNA测序产牛的总读数．共得到约480．700万条的有效读数。从表2-4可以看出其中匹配到miRNA的序列有200—300月条有效读数。嵌2-2小RNA测序产生的读数总拈Table2-2thetotalreadsofsmallRNAsequ明ce 中山大学博十学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义注：mapped指所有定位到基因组上的序列；GoodReads指高质量的序列；MiRNASense指定位到已知的miRNAs的序列2小RNA的片段长度分布情况从图2-4可以看出，小RNA的片段长度主要分布在18．25个核苷酸(nt)的范围内，符合miRNA的长度特点。1b+061●●+0812e-·OS’●+08暑EB∞OOO主800000‘∞000200000OLengthoIstr由呻∞’．．。。一．--_I一一一．。一30— 中山大学博l‘学化论文肾癌忠青肾癌组织microRNA莘异表达发可能的临床意义表2-5非miRNA的其它小RNA小『d类别的分类!!!!!!：!!竺竺12111竺!!!墨!坐竺!竖!竺竺!!!竺坚竺壁竺!塑!!竺SampleMt_rRNAtRNAsaoRNArRNAmisc_RNAseRNAsnRNA对于小RNA各组分的分布．我们进行了比较，发现miRNA所占比例虽高，达到782％，其次为rRNA，约162％．地图2-5图2-5小RNA再组分的分布陌Figure2-5thedis”ibutionofthesmallRNAinthesolexasequencing一)一～一『 中山大学博士学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义四．miRNA的表达情况：对所有12个miRNA表达库(FI．L7)进行分析，将它们分为肾癌组织和癌旁正常组织组，采用配对t检验，进行miRNA的表达谱分析，发现在男性和女性患者中，共有64个miRNA的表达异常。其中上调表达24个，下调表达40个。1．肿瘤中表达下降的miRNA在肾癌组织中下调表达的40个miRNA中，miR-138．2幸下降最明显，其次是miR一508—5p和miR-610等。(见表2-6)2．肿瘤中表达升高的miRNA在肾癌组织中上调表达的24个miRNA中，let．7家族显示整体上升趋势，其次miR．21，miR-155的表达也明显上升。(见表2．7)一32— 中山大学博．I：学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的l临床意义表2-6．肿瘤【|l表达下降的miRNATable2-6down—regulatedmiRNAinrenalcellcarcinoma一33— 中山大学博士学位论文肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义表2．7．肿瘤中表达升高的miRNATable2-7up—regulatedmiRNAinrenalcellcarcinoma我们把含有相同Seed(miRNA第2．8位)的miRNA聚类为同一家族，了解在男女患者中的miRNA差异表达。3．男性患者中表达差异的miRNA家族将男性患者分为正常组和肾癌组，比较两组之间miRNA的表达差异，发现共有18个miRNA家族在两组之间存在差异(见图2—6)。4．女性患者中表达差异的miRNA将女性患者分为正常组和肾癌组，比较两组之间miRNA的差别，发现共有8个miRNA家族在两组之间存在差异(见图2．7)。一34— 中山大学博十学伸论文肾癌患者肾癌组织mieroRNA差异袁选及可能的临床意义㈦◆|{竺兰鬈燮5圉2-6男性忠者肾癌组织中有I8个miRNA家族表达赭异Fig2·6】8mJRNAfamiliesaresignificantlydifferemlyexpressedinmalecarcinomaandnomt8】tIssue图2．7女性患者肾癌组织中育8个rmRNA家族表达差异Fig2-7RmieroRNAfamiliesaresignific锄ttydifferentlyexpressedinfemalecarcinomandnormaltissue 中山大学蚺士学位论史肾癌患者肾癌组织mieroRNA差异表达及可能的临床意义五．新的候选miRNA的预测通过牛物信息学分析方法．我们共得到100多个新的候选miRNA基凼。但是这些候选miRNA的表达水平都较低，初步研究并未检测到它们在正常组织和癌组织中存在显著的表达差异。大．宴时夔光定量PCR对测序结果中差异寰达的mlRNA的验证对测序中发现的差异表达的miRNA．我们选取上调表达明显的miR-let-7a、miR-155、miR．142．3p、miR-24和下调表达显著的miR．200c这5个成熟miRNA进行实时荧光定量PCR检测，分析其表达情况。以嘶sBRNA作为内参．每个样本设3个复孔，取平均值为检测结果。为了消除标准曲线、样本、逆转录及PCR反应间的差异，在保证扩增效率一致的条件下，利用样本miRNA与U6snRNA基因含量的比值，作为评价miRNA相对表达水平的指标。根据公式AC卢[Ct(miRNA)]一[Ct(U6snRNA)]、AAC卢[ACt(肾癌组)】一【△ct(对照组)】，2出口表示肾癌组miRNA相对于正常对照组原始拷贝数的倍数差异，即表示miRNA在两组表达的相对变化。圈2-8分别显示Id．7a、miR一155、miR一142-3p、miR-24和miR．200c及内参U6snRNA定量PCR的扩增曲线和溶解嶂线。AG -}|}lJ大学博十学化论丘：肾癌忠者肾癌组织micmRNA差异袭达及可能的临眯意义～㈦∥，一～。‘，矿⋯广————7万———一●{，一Ij—I．。IC⋯～一HDJ；I：m飘妇⋯⋯一=曼!强⋯⋯=EK 巾山大学博十学位论文肾癌患者肾癌纽织mlcroRFIA差异表达及可能舶临床意义}FFL图2-8mIRFIA及内参U6snRNA定量PER扩增曲线发溶解曲线Figure2-8咖hmgoln．veandamplificationCUl～eofmiRNAandU6snRNAA．F分别为扩增曲线(AIct-7a；BmiR-24；CmiR-142-3P；DmiR．155；EmiR．200c；EU6slIRNA．)G-1分别为熔解曲线(Glet-7a；HmiR-24；I．miR．142．3P；JmiR-155；KmiR-200c；LU6snRNA)定量PCR结果如图2-9所示。结果证实了芯片结果的上E确性，在6个肾癌组织中，l毗-7、mir-24、mir-142．3p和mir-155与正常对照比较均显著升高，miR-200c在肾癌组织中表达显著下降(P