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1、肾癌组织中Wnt5a的表达及其临床意义［摘要］目的探讨Wnt5a在肾癌组织屮的表达与病理意义以及对肾癌细胞增殖及侵袭潜能的影响，为寻找肾癌有效的治疗途径及预后判定指标提供依据。方法对43例肾癌组织标本和11例正常肾组织标本中的Wnt5amRNA和Wnt5a蛋白表达水平进行检测，分析肾癌组织Wnt5amRNA表达与临床病理特征的关系，及Wnt5a蛋白表达与预后的关系。结果Wnt5amRNA和Wnt5a蛋白在肾癌组织屮的阳性表达率均显著高于正常肾组织(P〈0.05)o肾鳞癌的Wnt5amRNA表达水平明显高于肾腺癌(P<0.01)；低分化组显著高于高分化组
2、(P<0.01)oWnt5a蛋白阳性的肾癌患者2年生存率明显低于阴性患者(P<0.01)o结论Wnt5a表达水平在肾癌细胞中明显增高，且与肾癌的细胞分化程度、组织类型及预后密切相关，提示Wnt5a可能参与肾癌的发生发展过程。［关键词］Wnt5a；肾癌细胞；侵袭转移；影响［中图分类号］R737.11［文献标识码］A［文章编号］1673-7210(2013)08(c)-0029-03肾癌是一种发病率较高的恶性肿瘤，近年来其发病率呈逐步增高的态势［1］。有研究报道，约有1/5发病的恶性肿瘤为肾癌，在总癌症死亡数中因肾癌死亡的占23・8%［2］。虽然近年来随着
3、各种新手段、新方法、新技术的不断涌现，但有关肾癌患者总生存率方面的研究仍然没有取得实质性的进展。研究发现，Wnt5a的表达与肿瘤细胞侵袭转移显著相关，提示患者短生存期及预后不良。因此，深入研究Wnt5a与肾癌的关系具有重要意义。1资料与方法1.1一般资料选取南华大学附属第二医院2011年3月〜2012年3月收治的43例肾癌患者，其中，男31例，女12例；年龄32〜72岁，平均（56.7±4.5）岁；I〜II期21例，III〜IV期22例。均经手术治疗及病理学确诊，术前未接受放、化疗，均有完整的术后随访记录，牛存时间的计算从手术日期到由于复发或转移而死亡
4、的日期或末次随访日期为止，随访期1〜24个月。另选取11例非肾癌病例的正常肾组织作为对照，其中，男7例，女4例;年龄30〜65岁,平均（50.4±4.8）岁。1.2方法43例肾癌组织标本和11例正常肾组织标本均为于术时获取，所有标木分成两份，一份于无菌条件下釆集，并放入经二乙基焦碳酸酯（DEPC）处理过的Ep管内，液氮保存，行荧光实时定量RT-PCR,检测Wnt5amRNA表达水平；一份于10%中性福尔马林中固定，石蜡包埋处理、保存，行Wnt5a蛋白的免疫组化染色。1.2.1荧光实时定量RT-PCR检测肾癌组织和正常肾组织Wnt5amRNA表达1.2.
5、1.1标本处理将50〜100mg组织标本放入Ep管中，剪碎，加入1mLTrizol,匀浆。1.2.1.2RNA分离吸入1.5mLEp管内,室温静置5min；加入0.2mL氯仿，剧烈振荡Ep管15s后，室温孵育5min；配平，4°C12000r/min离心15mino1.2.1.3RNA沉淀吸取上层水相，置于另一个1.5mLEp管屮，加入0.5mL异丙醇，充分混匀后-20°C放置1h,4°C10000r/min离心10min。1.2.1.4RNA清洗弃上清,加入75%的乙醇1mL,室温放置5min；4°C10000r/min离心10min,移去上清，吹干
6、、沉淀。1.2.1.5RNA再溶解去乙醇，室温干燥5min；加入100uLDEPC处理的ddH20,取3uL加3mLddH20,10uL电泳，其余标本放入-70°C保存。1.2.1.6RNA浓度测定用99nLDEPC水稀释、混匀，用紫外分光光度计分析、计算RNA浓度。1.2.1.7RNA完整性检测制备1・5%琼脂糖凝胶，行RNA完整性检测。于紫外灯透视下观察电泳结果，应可见3条28s、18s和5sRNA的清晰条带。将完整的RNA样品保存于-80°C冰箱备用。1.2.1.8eDNA第一条链合成取1ug总RNA应用逆转录试剂盒行逆转录以合成第一条链eDNA
7、,-20°C保存备用。1.2.1.9检测实时荧光定量PCR检测目的基因和内参基因表达。1.2.2免疫组化染色检测肾癌组织和正常肾组织Wnt5a蛋白表达经载玻片处理、石蜡切片、脱蜡、水化后，用3%H202孵育10min,蒸馆水漂洗1minX3次，PBS浸泡5min,将抗原微波修复15min后，室温放置30min,PBS漂洗1minX3次，加入5%〜10%山羊血清封闭，室温放置10min,加入一抗，37°C孵育2h,PBS漂洗5minX3次，加入二抗，37°C孵育20min,PBS漂洗5minX3次，加入DAB显色，冲洗，苏木素复染，脱水，透明，封片。1.
8、3判断标准Wnt5amRNA阳性判断标准：RT-PCR产物电泳后在紫外光下出现一条538bp的
