膀胱上皮特异性重组腺病毒的构建及其抑制作用

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1、摘要背景：膀胱癌的基因治疗途径已显现研究前景。重组腺病毒目前用于基因治疗。目的基因在靶组织中的差异表达在基因治疗中很重要，一种方法是用组织特异性启动子驱动治疗基因表达。本研究是构建膀胱上皮特异性重组腺病毒，探讨其在膀胱癌细胞中的抑制作用。方法：RT-PCR分析用于鉴定几种细胞株中hUPII和柯萨奇腺病毒受体(CAR)的表达。瞬时转染和荧光素酶检测试验用于鉴定hUPII启动子的组织特异性。从RpS-TOAD．PSE．PBN-E1A载体酶切得到E1A片段。用引物从CPll31载体扩增得到hUPII启动子片段。EIA片段

2、和hUPII启动子片段插入穿梭载体RpS-TOAD建立Rp—UPII-EIA载体。从Rp-UPII—EIA载体中切除EIA片段建aff_Rp-UPII—Null载体。Rp_UPII—E1A和Rp-UPH-NuU分别与pAdEasy-1通过电穿孔共转染大肠杆菌BJ5183的电转化感受态细胞。阳性质粒转入人肠杆菌DH5a中用于大量扩增。两种阳性质粒PacI酶切后通过Upofcctamine2000转染293细胞。7天后收获病毒。病毒在293细胞中增殖到足够量后，用常规Csa离心纯化腺病毒。用UV-SDS法和TCID50

3、法测定病毒滴度。提取Ad—UPII-E1A和Ad．UPII—Null的病毒DNA，用特异于E1A基因和UPII启动子的引物的PCR证实。用重组腺病毒Ad．UPII．E1A和Ad．UPII．Null感染细胞48d,时后，用Westemblot检测E1A蛋白在BIU．87细胞中的表达。检测了重组腺病毒Ad—UPII—E1A在膀胱癌细胞株BIU．87中的抑制作用。结果：在膀胱癌细胞株BIU一87中表达hUPII和柯萨奇腺病毒受体(CAR)。在膀胱癌细胞株BIU．87中hUPII启动子活性高。用细菌中同源重组技术把hUPI

4、I启动予和E1A基因插入5型重组腺病毒基因组中。在Ad．UPII．E1A的病毒DNA中有E1A基因和UPII启动子，在Ad．UPII—Null的病毒DNA中仅有UPII启动子没有E1A基因。在重组腺病毒Ad．UPII．E1A感染的BIU．87细胞中EIA蛋白明显阳性。M兀试验表明重组腺病毒Ad．UPII．E1A抑制膀胱癌细胞BIU．87的生长。结论：hUPII启动子组织特异性高。构建和验证了重组腺病毒Ad．UPII．E1A和Ad．UPII．Null。在膀胱癌细胞株BILl．87中重组腺病毒Ad．UPII．E1A的抑

5、制作用是显著的。关键词基因治疗；重组腺病毒；人uroplaMnII；膀胱癌细胞株VAbstractBackground：Genetherapeuticapproachestobladdercancerhaveshownresearchpromise．Recombinantadenovirusescurrentlyareusedforgenetherapy．Thedifferentialexpressionofthedesiredgeneinthetargettissueisessentialforgenethera

6、py．Aimofthestudyistoconstructurothelium-specificrecombinantadenovirusandinvestigateitsinhibitioninbladdercancercell．Methods：RT-PCRanalysiswasusedtodetermineexpressionpatternsofhUPIIandCoxsackieadenovirusreceptoronmultiplecelllines．Transienttransfectionandlucif

7、erasedetectingassaywereusedtodetecttissuespecificityofthehUPIIpromoter．EIAfragmentsweredigestedfromthevectorRpS—TOAD-PSE-PBN-EIA．HUPIIpromoterfragmentswereamplifiedfromthevectorCPll31withprimers．E1AfragmentsandhUPIIpromoterfragmentswereinsertedintopShuttlevect

8、orRpS-TOADtocreatethevectorRp—UPII—EIA．E1AfragmentswerecutofffromthevectorRp-UPII—E1AtoestablishthevectorRp-UPII—Null．Rp—UPII-E1AandRp—UPII-NullwerecotransfectedwithpAdEasy-1byelec