EB病毒早期基因BHRF1转基因模型鼠的建立

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1、EB病毒早期基因BHRFI转基因模型鼠的建立摘要EBV早期基因BHRFl是近年来确认的一种新的EBV致癌基因，体外可引起细胞转化，可能代替LMPl在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。EBV只感染人及高等灵长类动物，缺乏合适的体外复制增殖体系，转基因小鼠能很好地模拟体内的生理、病理环境，因此建立BHRFl转基因小鼠有助于整体水平明确BHRFl抗凋亡机制以及与bcl．2功能的异同，为深入研究BHRFl的生物学特性以及探讨EBV致瘤机制提供理想的动物模型。目的构建稳定表达BHRFl蛋白的重组载体，通过显微注射法建立EB病毒早期基因BH

2、RFl转基因模型鼠。方法①．培养淋巴瘤细胞系B95．8细胞，TRIzol法提取其RNA，反转录合成eDNA，作为PCR模板；采用Primerpremier5．0软件设计BHRFl基因的特异性引物，且在上下游引物的57端分别引入EcoRI和EcoRV双酶切位点及保护碱基，应用RT-PCR扩增BHRFl基因。②．将目的基因BHRFl与pMDl8一T载体连接，构建成pMDl8-T-BHRFl。③．分别用EcoRI和EcoRV双酶切pMDl8-T-BHRFl和peDNA(TM)3．1(+)载体，切取目的基因BHRFl和pcDNA3．1(

3、+)连接，构建pcDNA3．1一BHRFl重组载体。④用NruI和DraIII双酶切pcDNA3．1．BHRFl，酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳，然后QIAquiek胶回收纯化试剂盒回收含有CMV启动子、插入的目的基因BHRFl及BGHpolyadenylation的DNA片段，然后溶于显微注射缓冲液(pH7．4)中，注射浓度为3ng／IxL。⑤．首先结扎雄性小鼠，待恢复后制备假孕小鼠，同时制备供卵小鼠，处死供卵小鼠取受精卵，将含目的基因的DNA片段用显微注射法注入小鼠受精卵原核，进而将导入转基因的受精卵移植至假孕动物输卵管，发育

4、产子鼠。⑥．提取首建转基因小鼠鼠尾组织DNA，PCR鉴定有无目的基因的整合。结果①．RT-PCR扩增获得699bp的BHRFl目的基因片段，并与pcDNA3．1质粒载体连接，经PCR检测、限制性内切酶鉴定以及测序证实目的基因BHRFl正确插入pcDNA3．1质粒载体，成功构建重组质粒pcDNA3．1．BHRFl。②．NmI和DralII双酶切重组质粒pcDNA3．1．BHRFl，电泳结果可观察到约2000bp的CMV+BHRFl+polyADNA片段以及约4100bp载体片段，将CMV+BHRFI+polyADNA片段回收纯化，

5、用于显微注射。③．选择超排小鼠数20只，见栓数量18只，选取健康受精卵480枚，通过显微注射的方法，将纯化的CMV+BHRFI+polyADNA片段分别注射入480枚小鼠受精卵，短暂培养后390枚受精卵仍健康，移入14只假孕母鼠输卵管内，11只怀孕，产下74只子鼠。④．PCR检测鼠尾组织DNA获得16只阳性首建鼠，阳性率为21．6％(16／74)。结论本实验首次建立了BHRFl转基因首建鼠，有望为进一步研究EBV早期基因BHRFl的生物学特性、深入探讨BHRFl在EBV相关肿瘤发生发展的作用提供了理想的动物模型。研究生：李欣(病

6、原生物学)导师：罗兵教授关键词：爱波斯坦．巴尔病毒；BHlⅫ1；转基因小鼠；显微注射EstablishmentoftransgenicmiceofEBvirusearlygeneBHRFlabstractEBVearlygeneBHRF1wasconfirmedtobeanewEBVoncogeneinrecentyears．Itcancausecelltransformation／nvitro，andprobablyplayanimportantroleinoccurrenceanddevelopmentinEBV-assoc

7、iatedtumor．However,EBVcanonlyinfecthumanbeingandafewprimates，andhavenosuitablereplicationsystem／nvitro．Transgenicmicecouldcorrectlymimicthephysiologicalandpathologicalenvironment／nvivo．Therefore，establishmentofBHRFltransgenicmiceclearlycontributetoelucidatetheexactan

8、ti-apoptoticmechanismsofBHRF1codingprotein，aswellasthesimilaritiesanddifferencesinfunctioncomparedwiththebcl一2．Itwillbecomeidealani