rig-i转基因鸡模型建立及抑制流感病毒活性的研究

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1、分类号：Ｓ８５５３学校代码；１０７５８密级：公开学号：口；３６〇２０３１８疫务爹乂＃硕壬学位论义ＲＩＧ－Ｉ转基因鸡模型建立及抑制流感病毒活性的研究ＲｅｓｅａｒｃｈｏｎＲＩＧ－ＩＴｒａｎｓｅｎｉｃＣｈｉｃｋｅｎＭｏｄｅｌＥｓ化ｂｌｉｓｈｍｅｎｔａｎｄｇＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＩｎｆｌｕｅｎｚａＶｉｒｕｓＡｃｔｉｖｉｔｙ研究生姓名周长良导师姓名及职称冉多良教授合作导师姓名及职称孟庆文副研究员—学位口类疑别农学硕壬￣专业葦称

2、预京兽度学研究方向善度微生物与分子生妨学所在学院动物医学学院■■新疆？乌鲁木齐—－二〇五年六月■■、－．．？．：’：１．Ｖ独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究王作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得新疆农业大学或其他教育单位的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并

3、表示了谢意。研究生签名：时间：９。化年月曰］司／关于学位论文使用援权的说明疆农本业人大完学全有权了保解新疆农业大学有关保留、使用学位论文的规定，目Ｐ：新留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子文文档被，可查采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，允许论入有阅和借阅。本人授权新疆农业大学将学位论文的全部或部分内容编关数据库进行检索，可Ｗ公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）研究生签名；巧於良时间；年＾月ＶＬ日导师签名时

4、间：月＞０＾年／＞＞曰■本文由“十二五”农村领域国家科技计划课题“鸡重要抗病基因的筛选及抗病育种新技术研究（项目编号：2011AA100305-2）”的支持课题主持人:孟庆文RIG-I转基因鸡模型建立及抑制流感病毒活性的研究摘要维甲酸诱导基因I(retinoicacidinducible-geneI,RIG-I)是机体天然免疫系统中一类重要的模式识别受体，能够识别病毒RNA，诱导Ⅰ型干扰素、细胞因子及趋化因子的产生，对机体抗病毒天然免疫的建立有重要作用。本实验旨在建立表达RIG-I的转基因鸡模型，通过

5、细胞水平的研究来揭示在表达RIG-I的F1代CEF细胞中是否重新建立了RIG-I信号通路，并具有抑制流感病毒活性的作用。本研究采用赤道开窗法，将符合注射标准滴度的重组慢病毒通过显微注射针注射到受精蛋胚盘下腔，成功培育了转入RIG-I基因的F0代转基因鸡；运用PCR、Southernblot、RT-PCR、Westernblot分别在DNA、RNA、蛋白质水平对F0代鸡进行鉴定分析；结果表明，15只F0代转基因鸡中6只有RIG-I基因的整合和表达；选取F0代表达RIG-I的转基因公鸡与同品种野生型母鸡进行杂交繁育

6、F1代，利用上述相同的方法对F1代转基因鸡进行鉴定分析；结果表明繁育的部分F1代转基因鸡中7只有外源基因的整合和表达，证明表达RIG-I的F0代转基因鸡携带的外源基因能够遗传至F1代。分离与培养F1代的CEF细胞，经分子生物学方法鉴定后，将其分为转基因组（TG）、非转基因组（NTG）和野生型组（WT）。用禽流感病毒感染CEF细胞，通过Westernblot测定RIG-I蛋白的表达量，间接免疫荧光（IFA）和TCID50测定流感病毒的复制情况，荧光定量PCR（qRT-PCR）检测RIG-I及其下游IFN-β，抗病

7、毒分子（PKR，OASL，MX1），促炎症细胞因子（IRF7，IFIT5）以及流感模型基因（PB2）的mRNA水平。qRT-PCR和Westernblot结果表明，TG组CEF细胞中感染组RIG-I的mRNA水平和RIG-I蛋白的表达量均高于未感染组；TG组与WT组相比，IFN-β上调2.4倍，其他细胞因子IRF7，IFIT5，PKR，OASL，MX1分别上调了2.1倍，1.5倍，1.9倍，2倍，1.9倍；IFA、TCID50与PB2基因拷贝数的结果表明TG组CEF细胞中流感病毒的增殖量均低于WT组。本研究获得

8、的F0代RIG-I转基因鸡体内有外源基因的整合与表达，其携带的外源基因能够稳定遗传至F1代；证明了在表达RIG-I的F1代CEF细胞中重新建立了RIG-I信号通路，并具有抑制流感病毒的作用。为探索RIG-I基因在鸡体内参与家禽天然免疫的机制及抑制流感病毒复制的作用奠定了基础，并可为药物开发等应用研究提供新的思路。关键词：RIG-I；转基因鸡模型；H5N1流感病毒；病毒活性抑制IRese